顧宏周團(tuán)隊(duì)開發(fā)利用環(huán)化酶高效制備DNA單環(huán)和拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的新技術(shù)
環(huán)狀單鏈脫氧核糖核酸（circular ssDNA）在分子生物和DNA納米技術(shù)等領(lǐng)域扮演著重要的角色，如作為滾環(huán)擴(kuò)增的必備模板、DNA拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的構(gòu)成單元等。目前常用的依賴于T4 DNA連接酶制備環(huán)狀單鏈DNA的方法容易產(chǎn)生多聚體副產(chǎn)物，導(dǎo)致單體環(huán)產(chǎn)率低；而現(xiàn)有的基于CircLigase（一種單鏈環(huán)化酶）制備環(huán)狀單鏈DNA的方法雖然可一定程度上減少副產(chǎn)物，但是隨著底物DNA鏈長度的增大，CircLigase催化成環(huán)的效率急劇下降。因此，高效率地制備單鏈環(huán)形DNA仍是一個(gè)亟待解決的問題。
2020年12月31日，我院顧宏周團(tuán)隊(duì)在Analytical Chemistry雜志發(fā)表了題為“Programming CircLigase Catalysis for DNA Rings and Topologies”的論文，報(bào)道了一種基于CircLigase高效制備DNA單環(huán)和拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的新技術(shù)。這一技術(shù)主要通過在單鏈DNA末端設(shè)計(jì)雜交的結(jié)構(gòu)使得CircLigase參與的酶促反應(yīng)由不可控的熵變主導(dǎo)轉(zhuǎn)為可控的焓變主導(dǎo)，從而高效率（>75%產(chǎn)率）無副產(chǎn)物地合成DNA單環(huán)。該技術(shù)不僅將CircLigase的催化DNA成環(huán)產(chǎn)率穩(wěn)定地提升至75%以上，而且突破了CircLigase對于可環(huán)化的DNA片段的長度的限制，在幾百堿基的長鏈DNA上都得到了驗(yàn)證。課題組同時(shí)利用CircLigase預(yù)制備的單鏈DNA環(huán)作為起始組裝材料獲得了高純度的DNA拓?fù)淝短捉Y(jié)構(gòu)。
文章中首先確定了末端雜交結(jié)構(gòu)對高效成環(huán)的必要性，測試了一系列參數(shù)：如反應(yīng)溫度、末端互補(bǔ)配對堿基數(shù)、末端不配對堿基個(gè)數(shù)和末端堿基種類等對成環(huán)效率的影響，并建立了可以被CircLigase催化高效成環(huán)的單鏈DNA模型。文章中還進(jìn)一步地研究確定了對于較長（例如200至500個(gè)堿基）單鏈DNA底物鏈，末端雜交結(jié)構(gòu)同樣能幫助其高效成環(huán)。
此外，該團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)末端雜交結(jié)構(gòu)可以從DNA分子內(nèi)轉(zhuǎn)移至DNA分子間，即末端雜交結(jié)構(gòu)也可提高兩條不同單鏈DNA分子間的連接效率。并且末端雜交結(jié)構(gòu)可以由單鏈DNA底物自身互補(bǔ)配對提供，也可以通過一條輔助DNA鏈與單鏈DNA底物末端配對形成，兩種雜交方式連接效率相當(dāng)。隨后，又提出末端結(jié)構(gòu)通過拉近單鏈DNA底物5’和 3’端距離，從而提高CircLigase催化成環(huán)效率的猜想。
綜上，該團(tuán)隊(duì)提出了一種簡單有效的在單鏈DNA末端設(shè)計(jì)雜交結(jié)構(gòu)的策略提升CircLigase催化DNA成環(huán)的效率，而高產(chǎn)率和高純度制備環(huán)狀DNA不僅在納米技術(shù)方面有潛在應(yīng)用，也可用來篩選更加穩(wěn)定的作為腫瘤診斷和治療的新一代核酸適配體。值得一提的是，CircLigase本身在病毒中作為一種RNA連接酶。由于DNA與RNA化學(xué)結(jié)構(gòu)相似，因此該研究中設(shè)計(jì)末端雜交結(jié)構(gòu)提高CircLigase環(huán)化DNA效率的策略理論上也適用于RNA底物。利用這套策略原則上也可以穩(wěn)定高效地合成天然存在的環(huán)狀RNA分子，以便在體外研究其結(jié)構(gòu)和功能。
復(fù)旦大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院研究生李青婷為第一作者，顧宏周研究員為通訊作者。
原文鏈接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.analchem.0c04668
版權(quán)與免責(zé)聲明：本網(wǎng)頁的內(nèi)容由收集互聯(lián)網(wǎng)上公開發(fā)布的信息整理獲得。目的在于傳遞信息及分享，并不意味著贊同其觀點(diǎn)或證實(shí)其真實(shí)性，也不構(gòu)成其他建議。僅提供交流平臺(tái)，不為其版權(quán)負(fù)責(zé)。如涉及侵權(quán)，請聯(lián)系我們及時(shí)修改或刪除。郵箱：sales@allpeptide.com