黃志偉課題組在《自然》發(fā)表論文揭示CRISPR-Cpf1識別crRNA以及剪切pre-crRNA的機(jī)制
哈工大報(bào)訊（閆明星/文蘭銳/圖）4月21日，我校生命學(xué)院黃志偉教授課題組在《自然》（《Nature》） 在線發(fā)表了題目為《CRISPR-Cpf1結(jié)合crRNA的復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)》（《The crystal structure of Cpf1 incomplex with CRISPR RNA》）的研究論文。該項(xiàng)研究通過結(jié)構(gòu)生物學(xué)和生化研究手段揭示了CRISPR-Cpf1識別CRISPR RNA （crRNA）以及Cpf1剪切pre-crRNA成熟的分子機(jī)制，這對認(rèn)識細(xì)菌如何通過CRISPR系統(tǒng)抵抗病毒入侵的分子機(jī)理具有十分重要的科學(xué)意義，而且為成功改造Cpf1系統(tǒng)，使之成為特異的、高效的全新基因編輯系統(tǒng)提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，讓人們可以更加高效地對目的基因進(jìn)行“關(guān)閉”、“恢復(fù)”和“切換”等精準(zhǔn)“手術(shù)”，使戰(zhàn)勝癌癥和艾滋病等疾病成為可能。
CRISPR-Cas系統(tǒng)是細(xì)菌編碼的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，該系統(tǒng)通過RNA引導(dǎo)的效應(yīng)蛋白剪切病毒的DNA或者RNA從而抵抗病毒的感染。該系統(tǒng)之一的CRISPR-Cas9系統(tǒng)被用來作為可編程的基因編輯工具用于細(xì)胞內(nèi)目的DNA的剪切、激活表達(dá)、修飾、突變等。由于CRISPR-Cas9系統(tǒng)能夠在活細(xì)胞中高效地、便捷地“編輯”任何基因，作為科研、醫(yī)療等領(lǐng)域的強(qiáng)有力工具，已被廣泛地應(yīng)用于全世界的生物和醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室。
剛剛發(fā)現(xiàn)的CRISPR-Cpf1系統(tǒng)是一類新型的CRISPR-Cas系統(tǒng)，能夠在crRNA引導(dǎo)下在人類細(xì)胞內(nèi)剪切目的DNA底物。而且，Cpf1本身也是一個(gè)具有序列特異性的RNase,這也是目前發(fā)現(xiàn)的唯一一個(gè)具有核酸序列特異性且同時(shí)具有DNase和RNase活性的核酸酶。Cpf1和Cas9很大的不同還在于：Cpf1僅需要一個(gè)拷貝的crRNA，而Cas9需要序列更長的tracrRNA和crRNA去識別、剪切底物DNA，較短的crRNA在轉(zhuǎn)染細(xì)胞過程中將更高效；Cpf1和Cas9識別DNA底物上的模塊（PAM）也不同；Cpf1剪切底物是通過粘性末端剪切，而Cas9是末端剪切，粘性末端剪切將更有利于基因編輯后的修復(fù)。
在該項(xiàng)研究中，黃志偉課題組首先解析了結(jié)合了crRNA的Cpf1復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)。非常意外的是，Cpf1并不是之前人們推測的二聚體狀態(tài)，而是一個(gè)呈三角形的單體，位于該結(jié)構(gòu)中間是一個(gè)帶有正電荷的凹槽。crRNA通過發(fā)卡結(jié)構(gòu)形成高度扭曲的構(gòu)象緊密結(jié)合在Cpf1的核酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域，和底物DNA配對的crRNA 3'末端位于Cpf1凹槽的一端。和Cas9結(jié)合的sgRNA顯著不同的是，Cpf1結(jié)合的crRNA的引導(dǎo)序列部分（guide sequence）并沒有電子密度，這說明在沒有底物結(jié)合的狀態(tài)下這部分序列和Cpf1的結(jié)合比較松散。據(jù)黃志偉介紹，結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn)一個(gè)緊密結(jié)合crRNA的六水合鎂離子對穩(wěn)定crRNA構(gòu)象激活Cpf1的催化活性非常關(guān)鍵。當(dāng)然，我們也不能排除鎂離子也同時(shí)直接參與了對底物的催化反應(yīng)。通過比較Cpf1和Cas9復(fù)合物的結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，LHD區(qū)域推測可能是雙鏈DNA底物結(jié)合的PAM區(qū)域。
該研究發(fā)現(xiàn)Cpf1在沒有crRNA結(jié)合的狀態(tài)下處于松散的構(gòu)象，crRNA的結(jié)合引起Cpf1發(fā)生顯著的構(gòu)象變化。與Cas9結(jié)合sgRNA極為不同的是，僅僅crRNA的重復(fù)序列部分（repeat sequence）就能引起Cpf1構(gòu)象的巨大變化，這反映了這類短小的crRNA與Cas9結(jié)合的長sgRNA的識別機(jī)制的巨大差別。該結(jié)構(gòu)顯示來自于H843、 K852以及K869催化殘基側(cè)鏈上的氮原子位于一個(gè)平面上，同時(shí)和RNA A(+20)的磷酸基團(tuán)形成氫鍵，該結(jié)構(gòu)證據(jù)表明Cpf1剪切pre-crRNA成為crRNA是一個(gè)堿催化的反應(yīng)。
黃志偉為本研究論文的通訊作者，該課題組的碩士研究生董德、大四本科生任寬和博士生邱小林3位同學(xué)為該論文的并列第一作者。清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院高寧教授實(shí)驗(yàn)室、王佳偉教授、范仕龍博士參與該研究的部分工作。上海同步輻射中心為晶體數(shù)據(jù)收集提供了及時(shí)有效的支持。本項(xiàng)目受到國家自然科學(xué)基金委、哈工大青年科學(xué)家工作室等基金的資助。值得一提的是，這是我校本科生第一次在該頂級期刊參與發(fā)表研究論文，該文章也是黃志偉課題組在我校成立實(shí)驗(yàn)室以來在病原與宿主相互作用領(lǐng)域發(fā)表在《自然》雜志上又一項(xiàng)研究成果。
文章鏈接：http://www.nature.com/nature/journal/vaop/ncurrent/full/nature17944.html
黃志偉教授和課題組成員在實(shí)驗(yàn)室
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