黃碩團隊iScience: 納米孔錯位測序方法NIPSS首次實現(xiàn)microRNA的單分子直接測序
MicroRNA (miRNA) 是一類長度約為22個核苷酸（22 nt）的非編碼小分子RNA，其短序列中蘊藏著豐富的功能信息，幾乎涉及了生命過程的方方面面，如生長發(fā)育、新陳代謝、病毒感染、免疫反應以及腫瘤的發(fā)生轉移等等(Kim et al., 2018)。MiRNA通過堿基互補配對作用靶向mRNA，調控基因表達進而實現(xiàn)這些功能。這一過程中，除了包含A、U、C、G四種經(jīng)典堿基的序列組合，存在于miRNA上的堿基修飾也發(fā)揮著重要的作用。已有研究證明，存在于miRNA的m6A修飾可以影響miRNA的生物合成過程(Alarcon et al., 2015)，并且，其修飾水平的紊亂與胃腸癌密切相關(Konno et al., 2019)。因此，通過對單個miRNA分子直接測序來破譯miRNA的序列及修飾信息，可以為理解生命過程及癌癥的診療提供寶貴的信息。
由于miRNA自身長度極短，現(xiàn)有技術還不能在單分子水平上直接讀取miRNA序列。常規(guī)的miRNA測序方法仍然需要逆轉錄后擴增的方法間接實現(xiàn)測序。然而，miRNA的修飾信息會在測序過程中因反轉錄和擴增而丟失，miRNA的直接測序仍是困擾研究者的一大難題，不利于通過測序精準定位miRNA上的核酸修飾信息，且從原理上無法對單個miRNA片段上的多種核酸修飾同時進行測序分析。納米孔測序技術作為新興的單分子測序技術，無需擴增，可以根據(jù)堿基自身的理化性質來讀取核酸序列，是最直接的核酸測序檢測方法。然而，現(xiàn)有納米孔測序技術更多關注于長讀長的基因組或轉錄組的直接測序，對于極短的非編碼RNA的直接測序還沒有相關報道。在技術層面上，現(xiàn)有納米孔測序平臺亦不適用于分析諸如miRNA在內的極短非編碼RNA。
近日，我院黃碩教授團隊借助新近研發(fā)的納米孔錯位測序技術（Nanopore Induced Phase-shift Sequencing, NIPSS），首次實現(xiàn)了miRNA的直接單分子測序，miRNA的序列及修飾信息亦可在測序過程中同步獲?。▓D1）。NIPSS技術作為近年來黃碩教授團隊原創(chuàng)開發(fā)的新型通用測序方法(Yan et al., 2019)，有別于現(xiàn)有納米孔測序技術僅能測序基因組或轉錄組，NIPSS對任意可以通過孔道的單分子分析物均可實施直接測序。雖然現(xiàn)有NIPSS測序技術的讀長僅有15個堿基（15 nt），但該讀長與天然成熟miRNA的全長（22 nt）極為接近，具有實現(xiàn)測序檢測的技術可行性，并在該工作中首次得到了技術驗證。
圖1. NIPSS技術用于miRNA直接測序方法原理及信號展示。
在該工作中，DNA-miRNA嵌合鏈被用做納米孔測序的模板鏈（圖2）。嵌合鏈可以通過使用T4 RNA連接酶連接待測miRNA 3端和DNA 5端來構建。在NIPSS測序過程中，DNA聚合酶合成DNA時，產(chǎn)生驅動力拉動嵌合鏈整體向cis側移動，由于“位差”的存在，其連接的miRNA堿基逐個通過納米孔識別位點，miRNA序列從而被納米孔直接讀取。原理上說，NIPSS技術的讀長由聚合酶合成位點與納米孔識別位點之間的“位差”決定，其長度等價于該工作中所使用的MspA納米孔道的高度，亦對應于miRNA 3端的15個堿基。雖然該讀長不足以完美覆蓋miRNA的全長，基于對現(xiàn)有全部人類miRNA的生物信息學分析 (http://www.mirbase.org/) ，該讀長足以直接區(qū)分99.5%的人類miRNA，已具備直接的應用性。作為概念驗證，研究團隊選擇對幾種與腫瘤關系密切的miRNA進行測序，包括致癌性miR-21和其變體miR-21+U (miR-21 3端單尿嘧啶添加產(chǎn)物)，以及抑癌性let-7a。幾種miRNA都給出了與各自序列相對應的特征測序信號。序列差異較大的miR-21與let-7a，以及序列高度相似的miR-21與miR-21+U，都實現(xiàn)了很好的區(qū)分。作為領域內的首個miRNA單分子測序方法，NIPSS技術展現(xiàn)了高的測序分辨率，這對其應用拓展，例如鑒定高序列相似度的miRNA家族成員或單堿基變異，具有直接的檢測價值。
圖2. NIPSS測序鏈DNA-miRNA的酶連接構建原理及結果表征。其中膠圖中標注為DNA-miRNA的明顯條帶為所構建的待測嵌合鏈。
在進一步的研究中，研究團隊探索了NIPSS技術表征miRNA上序列修飾的能力。M6A作為一種廣受關注的RNA 表觀遺傳學修飾，常見于mRNA。最近的研究表明，m6A修飾也存在于miRNA，并且具有生物學功能。然而目前還沒有方法能在miRNA序列中定位m6A。在該工作中，研究團隊在miR-21序列中人工引入了單個m6A修飾堿基（圖3）作為概念性驗證，進而在NIPSS測序過程中觀測到m6A產(chǎn)生的特異性測序信號。相比于經(jīng)典堿基A，m6A表現(xiàn)出更高的信號特征，從而能在miRNA序列中準確定位。相較于傳統(tǒng)的二代測序技術，NIPSS技術在單分子水平獲取miRNA序列的同時，序列修飾信息得以保留而被納米孔直接探測，是目前對miRNA修飾信息進行直接單分子測序檢測的唯一方法。
圖3. NIPSS技術用于m6A修飾檢測。
此外，黃碩教授團隊近年來致力于開發(fā)基于納米孔成像技術的低成本，高通量檢測裝置(Wang et al., 2019)，未來有望與NIPSS測序技術相結合，實現(xiàn)高通量的miRNA單分子測序。
工作以“Direct microRNA sequencing using Nanopore Induced Phase-shift Sequencing（NIPSS）”為題，發(fā)表在Cell Press旗下交叉學科期刊iScience上(DOI：https://doi.org/10.1016/j.isci.2020.100916）。我院化學化工學院博士生張金月和閻雙紅為該論文共同第一作者，黃碩教授為該論文通訊作者。此項研究得到了國家自然科學基金（項目編號：91753108、21675083、31972917）、中央高?；究蒲袠I(yè)務費（國際科技合作促進項目）（項目編號： 020514380142、020514380174）、生命分析化學國家重點實驗室（項目編號：5431ZZXM1804、5431ZZXM1902）、南京大學卓越計劃 (項目編號:ZYJH004)、中組部青年海外高層次人才計劃、江蘇省高層次創(chuàng)業(yè)創(chuàng)新人才引進計劃和南京大學科技創(chuàng)新基金項目等經(jīng)費支持。
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