點孔成金：黃碩團隊《Nature Communications》報道錐形生物納米孔道內(nèi)構(gòu)建的單原子金反應器
在科學與應用領域，金借助其特殊的理化性質(zhì)扮演了不可或缺的角色。首先，金具備極好的延展性、導電導熱性與紅外反射性等優(yōu)越的物理性質(zhì)，因此被廣泛的用作材料的鍍層或被用作電子器件中的導線與觸點。金亦具備獨特的化學性質(zhì)，可用作反應催化劑或新型藥物的制備。而在近年來興起的納米科學研究中，金被廣泛應用于種類繁多的納米結(jié)構(gòu)和探針的制備。如我們生活中常見的驗孕試紙便是使用了膠體形式的金實現(xiàn)檢測匯報。金的三價化合物氯金酸不僅是納米金的制備前體，也是最常見的金化合物，可以和蛋白質(zhì)乃至核酸堿基產(chǎn)生相互作用。受限于檢測儀器的時空分辨率，科研工作者常用的紫外-可見光譜、質(zhì)譜和核磁等表征手段并不適用于在單分子水平上深入探究包括Au(III)化合物在內(nèi)的極小分析物與生物大分子之間的動態(tài)相互作用。早期研究表明，氯金酸于水中電離產(chǎn)生的四氯化金離子可以抑制細胞膜上水通道蛋白的活性，然而其機理尚未明確（FEBS letters, 2002, 531(3): 443-447）。這就要求我們發(fā)展相應的新型分析方法來更加清晰的觀測這些現(xiàn)象。
生物納米孔技術(shù)是近年來發(fā)展迅速的單分子研究手段，并已在納米孔核酸測序領域取得了極為廣泛的關注。然而生物納米孔之所以能夠?qū)τ诤怂嵘系膯蝹€堿基實現(xiàn)分辨，正是源于其超高的動態(tài)分辨率，足以分辨小如單個原子的檢測分析物。實驗中，經(jīng)過改造的生物納米孔可以直接被用作納米反應器，從單分子層面中直接監(jiān)測化學反應過程。該方向的研究最早可追溯到1997年，英國牛津大學Hagan Bayley課題組通過設計構(gòu)建工程化溶血素(α-HL)納米孔，實現(xiàn)了對Zn2+, Cd2+等金屬離子與氨基酸殘基配位反應的單分子觀測(Chemistry & biology, 1997, 4(7): 497-505.)。但是受限于α-HL孔道的直桶圓柱形識別位點與較寬的孔體尺度，所有觀測到的信號都表現(xiàn)為極微弱的阻塞信號浮動（2-3 pA）。迄今為止，所有的基于生物孔道的單分子反應器均由溶血素(α-HL)納米孔構(gòu)建而成。
我院化學化工學院黃碩團隊在近期研究探索中意外發(fā)現(xiàn)Au(III)離子可以通過可逆的Au(III)-硫醚配位作用，與野生型α-HL納米孔中的甲硫氨酸殘基(M113)結(jié)合。但正如之前提到的，溶血素對于金屬離子的檢測信號較小，多元離子[AuCl4]-給出電流阻塞信號也只有5-6 pA，且檢測信號具有多種無規(guī)則波動，可能來源于Au(III)離子與直筒狀識別位點內(nèi)其它氨基酸（如賴氨酸）的非特異性相互作用所致。受到納米孔測序技術(shù)的啟發(fā)，黃碩團隊通過單個定點突變，將具有錐形識別位點的恥垢分枝桿菌孔蛋白A（MspA）納米孔內(nèi)腔中引入了甲硫氨酸，從而將該反應有目的的移植到了MspA納米孔最尖銳的識別位點，即91號位點處，并觀測到了對應的單分子反應信號（圖1，動圖1）。
圖1： MspA的單個[AuCl4]-離子傳感信號。(a).實驗示意圖。(b). Au(III)-硫醚配位的分子模型展示。(c).100 mV下1 μM [AuCl4]-離子的傳感信號。（圖片來源自該作者）。
動圖1：100 mV下MspA的單個金離子傳感信號
與α-HL的桶狀構(gòu)型相比，MspA整體呈錐形，其開闊的前庭可以引入更多的離子電流從而放大檢測信號，其狹窄的識別位點則提供了更高的空間分辨率，大大削弱了周圍氨基酸的干擾。在最大檢測電壓下，該單分子檢測信號可以達到55 pA（圖2）, 也是目前報道過的最大的納米孔單離子檢測信號。
圖2：α-HL和MspA的單個[AuCl4]-離子信號比對。(a). α-HL和MspA的構(gòu)型對比。α-HL的構(gòu)型為桶狀構(gòu)型，MspA則為錐形構(gòu)型.。(b). 100 mV 下α-HL和MspA的典型 [AuCl4]-離子信號展示。(c). 200 mV下MspA給出的[AuCl4]-離子信號。(d) 不同電壓下(20-200 mV) α-HL和MspA的的單個[AuCl4]-離子堵孔深度比較。（圖片來源自該作者）。
眾所周知，基于生物表達制備的生物納米孔道只可能形成20種天然氨基酸的空間組合。傳統(tǒng)的定點突變工程無法給生物納米孔到帶來任何氨基酸以外的化學性質(zhì)。而在單個金原子鑲嵌孔道內(nèi)時，MspA納米孔便具備了單個金原子的化學特性，形成了一個金原子內(nèi)嵌的黃金生物孔道，從而獲得了新的傳感功能，并可以直接對多種生物硫醇如L-半胱氨酸(Cysteine, Cys)，L-高半胱氨酸(Homocysteine, Hcy)和L-谷胱甘肽(Glutathione, GSH)進行單分子區(qū)分。生物硫醇分子具有活潑的巰基官能團，可以與[AuCl4]-離子形成更強的Au(III)-硫醇的相互作用，這樣，內(nèi)嵌于孔內(nèi)的金離子，可以作為一座金原子橋，一端連接納米孔上的硫醚，一端連接游離的硫醇分子，從而根據(jù)其獨特的反應中間狀態(tài)匯報生物硫醇的檢測信息（圖3，動圖2）。該傳感機制簡單，無需標記，檢測快速且經(jīng)濟高效，有希望設計為便攜式傳感器芯片用于臨床上的檢測。并且，Au(III)離子的嵌入可以為其他許多基礎科學研究項目提高思路，如啟發(fā)藥物分子靶點的設計，或設計更多的金屬內(nèi)嵌修飾構(gòu)建一系列金屬生物孔道(Metalloporin)來識別其它對應分析物，從而拓寬生物納米孔的單分子檢測功能，并有希望推進基于孔道的單分子蛋白質(zhì)測序研究。
圖3：生物硫醇傳感機理和對應傳感信號。(a).生物硫醇傳感機理的分子模型展示。(b). 半胱氨酸、同型半胱氨酸、谷胱甘肽的分子結(jié)構(gòu)式及對應的傳感信號。（圖片來源自該作者）。
動圖2：100 mV下MspA中金橋聯(lián)的半胱氨酸傳感信號
該工作以“Giant single molecule chemistry events observed from a tetrachloroaurate(III) embedded Mycobacterium smegmatis porin A nanopore”為題，于2019年12月11日在《Nature Communications》發(fā)表相關論文（DOI: 10.1038/s41467-019-13677-2，文章鏈接：https://www.nature.com/articles/s41467-019-13677-2）。我院化學化工學院博士生曹姣為該論文第一作者，黃碩教授為該論文通訊作者。此項研究得到了國家自然科學基金（項目編號：91753108、21327902、21675083、31972917）、中央高?；究蒲袠I(yè)務費（國際科技合作促進項目）（項目編號： 020514380142、020514380174）、生命分析化學國家重點實驗室（項目編號：5431ZZXM1804、5431ZZXM1902）、南京大學卓越計劃 (項目編號:ZYJH004)、中組部青年海外高層次人才計劃、江蘇省高層次創(chuàng)業(yè)創(chuàng)新人才引進計劃和南京大學科技創(chuàng)新基金項目等經(jīng)費支持。本工作在發(fā)表過程中獲得了我院陳洪淵院士、郭子建院士、趙勁教授、朱少林教授與朱從青教授的諸多寶貴意見。
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