蔣爭(zhēng)凡課題組發(fā)現(xiàn)STING活化所需共配體
cGAS是胞質(zhì)內(nèi)雙鏈DNA或Mn2+?的受體，也是一個(gè)二核苷酸環(huán)化酶，被DNA和/或Mn2+?激活后利用細(xì)胞質(zhì)中的ATP和GTP合成第二信使2’3’-cGAMP?，后者進(jìn)一步激活STING，最終介導(dǎo)抗病毒/腫瘤免疫反應(yīng)。而Mn2+?激活的cGAS以一種更高效路徑合成2’3’-cGAMP，Mn2+?單獨(dú)使用或與PD-1抗體聯(lián)合使用（錳免療法）可顯著增強(qiáng)腫瘤治療效果。cGAMP與STING結(jié)合后，STING需要從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)移到高爾基體才能夠被活化。但為什么STING活化必需從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)位至高爾基體一直是領(lǐng)域內(nèi)懸而未決的重要科學(xué)問題。已有的研究表明STING的轉(zhuǎn)位和激活緊密偶聯(lián)：阻斷膜泡運(yùn)輸?shù)囊种苿〣FA可完全阻斷STING的激活，而STING的自激活突變體則會(huì)自發(fā)的定位于高爾基體。更加有趣的發(fā)現(xiàn)來(lái)源于最近關(guān)于COPA綜合征的自身免疫疾病的研究。COPA是負(fù)責(zé)蛋白從高爾基體向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)回收的COPI復(fù)合體的關(guān)鍵亞基，其突變會(huì)導(dǎo)致逃逸到高爾基體的STING無(wú)法向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)回收，從而使STING在高爾基體累積并自激活，引發(fā)自身免疫疾病。攜帶COPA突變的細(xì)胞中STING的活化完全不依賴于cGAMP，說明定位于高爾基體的STING可自發(fā)活化，并提示高爾基體中存在STING活化所需的未知配體。
?
細(xì)胞間存在由細(xì)胞分泌的蛋白質(zhì)和多糖構(gòu)成的細(xì)胞外基質(zhì)。胞外基質(zhì)不僅為細(xì)胞提供支架，還對(duì)細(xì)胞存活、發(fā)育、遷移、增殖等有重要調(diào)控作用。粘多糖是一類在高爾基體合成的、由二糖重復(fù)單元構(gòu)成的直鏈線性聚合物，其主要成分硫酸化糖胺聚糖（sulfated glycosaminoglycans，sGAGs）是胞外基質(zhì)的重要成員，也是骨基質(zhì)和結(jié)締組織的主要成分?；诙菃卧牟煌M成，可將硫酸化糖胺聚糖分為四大類：①硫酸皮膚素（dermatin sulfate，DS）；②硫酸軟骨素（chondroitin sulfate，CS）；③硫酸角質(zhì)素（keratan sulfate，KS）；④硫酸類肝素（heparan sulfate，HS）和肝素（heparin，Hp）。硫酸化糖胺聚糖廣泛分布于細(xì)胞外基質(zhì)，細(xì)胞表面或胞內(nèi)膜泡（高爾基體、內(nèi)體及分泌小泡）。由于荷載大量帶負(fù)電的硫酸化修飾，細(xì)胞外硫酸化糖胺聚糖和靶蛋白上正電或極性氨基酸殘基結(jié)合，影響受體蛋白與其配體的相互作用或誘導(dǎo)受體寡聚，也被認(rèn)為是一些膜受體的共配體。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)粘多糖具有抗凝血、降血脂、抗病毒、抗腫瘤及抗放射等多種藥理活性作用。此外，粘多糖是動(dòng)物藥的活性成分之一，常見于皮（阿膠、海參、蟬蛻、蛇蛻等），骨（虎骨、狗骨等），角（犀角、鹿茸等），鱗甲（穿山甲、龜板、鱉甲、玳瑁等）及粘液（蝸牛、泥鰍等）等藥材中，這些藥材是我國(guó)數(shù)千年傳統(tǒng)醫(yī)藥文化的瑰寶。已有的研究表明胞外硫酸化糖胺聚糖在調(diào)控很多種生理學(xué)功能方面發(fā)揮重要的作用，但胞內(nèi)硫酸化糖胺聚糖的生理學(xué)功能知之甚少，它們參與天然免疫反應(yīng)的功能從未見報(bào)道。
?
? 2021年4月14日，生命中心蔣爭(zhēng)凡實(shí)驗(yàn)室在《Immunity》上以research article形式在線發(fā)表了STING為什么需要進(jìn)行高爾基體轉(zhuǎn)運(yùn)的機(jī)制研究“Golgi-synthesized sulfated glycosaminoglycans mediate polymerization and activation of the cGAMP sensor STING”，報(bào)道高爾基體內(nèi)合成的硫酸化糖胺聚糖作為STING共配體介導(dǎo)STING在高爾基體的活化。在本研究中，蔣爭(zhēng)凡實(shí)驗(yàn)室的方潤(rùn)博士和蔣啟飛同學(xué)巧妙地利用了STING自激活突變體誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的特性，在二倍體細(xì)胞HT1080中進(jìn)行了基于CRISPR–Cas9介導(dǎo)的全基因組篩選，發(fā)現(xiàn)多個(gè)參與硫酸化糖胺聚糖合成的關(guān)鍵基因被高度富集（圖1）。這些粘多糖合成關(guān)鍵基因的敲除使細(xì)胞喪失了對(duì)STING的反應(yīng)性。隨后，他們通過在不同細(xì)胞中構(gòu)建基因敲除細(xì)胞株，進(jìn)一步證明在高爾基體內(nèi)發(fā)生的硫酸化糖胺聚糖缺失會(huì)嚴(yán)重削弱cGAS-STING通路的激活。為了研究硫酸化糖胺聚糖是否直接作用于STING，他們選用了荷載硫酸化糖胺聚糖的核心蛋白SRGN作為硫酸化糖胺聚糖的指針，發(fā)現(xiàn)STING和SRGN存在DNA病毒誘導(dǎo)的共定位和相互作用（圖2A）。用攜帶肝素的磁珠進(jìn)行體外pull-down實(shí)驗(yàn)也表明STING和肝素存在直接的相互作用，且結(jié)合cGAMP的STING具有更強(qiáng)的肝素結(jié)合能力（圖2B）。硫酸化糖胺聚糖由于荷載大量帶負(fù)電的硫酸化修飾，因而主要通過靜電相互作用與靶蛋白上的正電氨基酸殘基結(jié)合來(lái)發(fā)揮功能。由于胞內(nèi)硫酸化糖胺聚糖存在于高爾基體腔內(nèi)，他們推測(cè)位于STING第一和第二跨膜區(qū)之間的三個(gè)正電氨基酸殘基（H42，R45，H50）可能參與結(jié)合硫酸化糖胺聚糖（圖2C）。將這三個(gè)正電氨基酸進(jìn)行突變會(huì)顯著削弱STING的激活（圖2D）。進(jìn)一步將位于STING第一和第二跨膜區(qū)及第三和第四跨膜區(qū)內(nèi)的極性氨基酸進(jìn)行突變則會(huì)使STING的活性逐步降低直至完全消失。有意思的是，回復(fù)上述三個(gè)正電氨基酸中的任意一個(gè)都可使完全沒有活性的突變體恢復(fù)部分功能。將42位或50位回復(fù)為電性更強(qiáng)的賴氨酸或精氨酸，STING的活性會(huì)隨著回復(fù)的氨基酸的正電荷增多而逐漸增強(qiáng)。有意思的是，在不含有正電氨基酸的第三和第四跨膜區(qū)引入正電氨基酸（P110R）也會(huì)部分回復(fù)突變STING的活性。免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)各種STING突變體與SRGN的相互作用強(qiáng)度和這些突變體的活性有非常一致的相關(guān)性；更重要的是，通過引入額外的帶正電的精氨酸（Y46R/H50R，H50R/P110R等）則會(huì)使STING組成性地結(jié)合硫酸化糖胺聚糖而發(fā)生自激活（圖2E）。這些結(jié)果表明硫酸化糖胺聚糖和STING的結(jié)合能力是決定STING能否激活及激活強(qiáng)度的決定因素之一。
?
?
為了進(jìn)一步研究硫酸化糖胺聚糖如何介導(dǎo)STING的激活，他們通過體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)多種硫酸化糖胺聚糖可不同程度地誘導(dǎo)STING全長(zhǎng)蛋白發(fā)生多聚體化并誘導(dǎo)激酶TBK1的活化，其中硫酸肝素（HS）和肝素（Hp）的激活效果最佳（圖2E）。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)硫酸化糖胺聚糖激活STING是糖鏈長(zhǎng)度依賴的，最短由四個(gè)單糖形成的糖鏈即具有激活STING的能力，并且這種激活依賴于糖鏈上的O-位硫酸化修飾。更為重要的是，通過對(duì)人、小鼠、蝙蝠和雞四種來(lái)源的STING進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，硫酸化糖胺聚糖介導(dǎo)STING激活的機(jī)制在進(jìn)化上是高度保守的。最后，他們通過小鼠實(shí)驗(yàn)表明硫酸化糖胺聚糖的合成對(duì)于小鼠抵抗DNA病毒感染十分關(guān)鍵。
綜上所述，該研究發(fā)現(xiàn)：1）STING活化需要兩種配體。第一種配體是環(huán)化二核苷酸（其中2’3’-cGAMP結(jié)合能力最強(qiáng)），與STING細(xì)胞質(zhì)一側(cè)的環(huán)化二核苷酸結(jié)合區(qū)域結(jié)合并導(dǎo)致STING轉(zhuǎn)位至高爾基體；第二種配體為本研究發(fā)現(xiàn)的高爾基體內(nèi)sGAGs，與STING高爾基體內(nèi)一側(cè)的正電荷（極性）氨基酸結(jié)合，像鉸鏈一樣引發(fā)STING多聚化，進(jìn)而招募并促進(jìn)TBK1自磷酸化及下游通路活化（圖3）。2）揭開了“為什么STING必需去高爾基體活化”這一重要的科學(xué)謎題，有望打通STING活化的“最后一公里”。3）填補(bǔ)了胞內(nèi)硫酸化糖胺聚糖的生理學(xué)功能研究的空白，揭示了生物多糖在細(xì)胞內(nèi)的關(guān)鍵免疫學(xué)功能，為未來(lái)生物多糖在抗病毒、抗腫瘤的臨床實(shí)踐提供新的線索。
北京大學(xué)生科院博士后方潤(rùn)和2015級(jí)PTN項(xiàng)目博士生蔣啟飛為該文章的共同第一作者，生命中心/生科院的蔣爭(zhēng)凡為通訊作者。本研究工作得到了生命科學(xué)聯(lián)合中心、國(guó)家自然科學(xué)基金委、科技部國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究項(xiàng)目及北京大學(xué)“細(xì)胞增殖與分化”教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的資助。
?
原文鏈接：https://doi.org/10.1016/j.immuni.2021.03.011
版權(quán)與免責(zé)聲明：本網(wǎng)頁(yè)的內(nèi)容由收集互聯(lián)網(wǎng)上公開發(fā)布的信息整理獲得。目的在于傳遞信息及分享，并不意味著贊同其觀點(diǎn)或證實(shí)其真實(shí)性，也不構(gòu)成其他建議。僅提供交流平臺(tái)，不為其版權(quán)負(fù)責(zé)。如涉及侵權(quán)，請(qǐng)聯(lián)系我們及時(shí)修改或刪除。郵箱：sales@allpeptide.com