化工學(xué)院張志超教授團(tuán)隊(duì)在腫瘤標(biāo)志物的熒光可視化領(lǐng)域取得新進(jìn)展
大連理工大學(xué)化工學(xué)院化學(xué)生物學(xué)課題組在腫瘤標(biāo)志物的熒光可視化方向取得新進(jìn)展，成果發(fā)表在中科院化學(xué)大類一區(qū)雜志Analytical Chemistry （Anal. Chem.?2021, 93, 9669-9676），“題為Discovery of a fluorogenic probe for in situ pyruvate kinase M2 iso-form (PKM2) labeling through chemoselective SNAr with a binding site lysine residue”。文章第一作者為大連理工大學(xué)特評(píng)副教授王紫千，通訊作者為張志超教授。
基于反應(yīng)的turn-on型熒光探針是利用探針與分析物發(fā)生化學(xué)反應(yīng)前后熒光發(fā)生變化，實(shí)現(xiàn)對(duì)分析物特異性識(shí)別的一類熒光探針。該技術(shù)因具有操作簡(jiǎn)單，高靈敏性、高選擇性、低成本、無(wú)創(chuàng)、原位和實(shí)時(shí)檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛地應(yīng)用于生物、醫(yī)學(xué)、化學(xué)生物學(xué)等領(lǐng)域。對(duì)于蛋白質(zhì)類生物標(biāo)志物，基于反應(yīng)的turn-on型熒光探針通過(guò)與靶蛋白表面的親核性氨基酸殘基（半胱氨酸Cys、賴氨酸Lys、組氨酸His和酪氨酸Tyr等）發(fā)生取代反應(yīng)實(shí)現(xiàn)對(duì)靶蛋白的共價(jià)標(biāo)記，并伴隨著熒光變化。本課題組在2019年曾報(bào)道了一個(gè)通過(guò)SNAr反應(yīng)標(biāo)記Cys和Lys殘基的turn-on熒光探針，6-苯巰基-1-氧-1H-非那烯-2,3-二腈（AT-OPD，Analyst?2019,?144, 3260-3266）。但是這類探針因其具有較高的反應(yīng)活性，容易受到細(xì)胞內(nèi)大量存在的谷胱甘肽（GSH）等生物硫醇的干擾，無(wú)法實(shí)現(xiàn)對(duì)靶蛋白的特異性標(biāo)記。
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圖1.?AT-OPC1熒光標(biāo)記Lys反應(yīng)機(jī)理圖
在本研究中，王紫千副教授通過(guò)在AT-OPD衍生物2位引入弱吸電子能力的酯基和硝基苯等基團(tuán)，降低AT-OPD衍生物6位與親核性氨基酸殘基的反應(yīng)活性，獲得了一個(gè)在活細(xì)胞全蛋白質(zhì)組水平特異性識(shí)別丙酮酸激酶M2亞型（PKM2）的基于反應(yīng)的turn-on型熒光探針AT-OPC1。丙酮酸激酶M2亞型（PKM2）在多種人類癌細(xì)胞中高表達(dá)，促進(jìn)有氧糖酵解和合成代謝，是多種腫瘤的潛在生物標(biāo)志物。因此，利用熒光探針可視化研究早期癌癥發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中細(xì)胞內(nèi)PKM2水平的動(dòng)態(tài)變化，有利于癌癥的早期準(zhǔn)確診斷。
利用基于活性的分子探針技術(shù)結(jié)合蛋白質(zhì)酶切與LC-MS/MS實(shí)驗(yàn)，證明AT-OPC1在細(xì)胞原位和蛋白質(zhì)組水平上特異性非共價(jià)結(jié)合PKM2蛋白之后，與賴氨酸殘基Lys305發(fā)生親核反應(yīng)并實(shí)現(xiàn)了熒光turn-on響應(yīng)，是第一個(gè)turn-on型PKM2熒光探針，能夠通過(guò)凝膠熒光成像和細(xì)胞熒光成像反映細(xì)胞內(nèi)PKM2蛋白的水平變化，實(shí)現(xiàn)對(duì)于腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞的區(qū)分，有望應(yīng)用于腫瘤的早期診斷。
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圖2.?加入AT-OPC1后，利用凝膠熒光成像和細(xì)胞熒光成像反映腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞PKM2蛋白的水平差異。
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該研究得到了國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目和大連理工大學(xué)-遼寧省腫瘤醫(yī)院醫(yī)工合作項(xiàng)目的資助。
論文鏈接：https://doi.org/10.1021/acs.analchem.1c00208
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