馬明團(tuán)隊(duì)利用生物合成和化學(xué)修飾制備新穎套索肽類天然產(chǎn)物
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2021年8月10日，北京大學(xué)藥學(xué)院天然藥物及仿生藥物國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室馬明研究團(tuán)隊(duì)在英國(guó)皇家化學(xué)會(huì)旗艦刊《Chemical Science》在線發(fā)表了題為“Rational Generation of Lasso Peptides Based on Biosynthetic Gene Mutations and Site-Selective Chemical Modifications”的研究論文，報(bào)道了一類獨(dú)特的套索肽天然產(chǎn)物的發(fā)現(xiàn)，以及利用生物合成基因突變和位點(diǎn)選擇性化學(xué)修飾制備套索肽衍生物的研究成果。
套索肽（lasso peptides）是一類結(jié)構(gòu)獨(dú)特的天然產(chǎn)物，結(jié)構(gòu)中常含有14-33個(gè)氨基酸殘基，其N端第1個(gè)氨基酸與第7，8或者第9個(gè)氨基酸側(cè)鏈形成大酰胺環(huán)，而C端的氨基酸穿過(guò)此大酰胺環(huán)，形成標(biāo)志性的“套索”結(jié)構(gòu)。此“套索”結(jié)構(gòu)具有極強(qiáng)的熱穩(wěn)定性和蛋白酶解穩(wěn)定性，因此套索肽被認(rèn)為是具有理想藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)的潛在藥用分子。根據(jù)是否含有二硫鍵以及二硫鍵的連接位置，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)四類套索肽。目前發(fā)現(xiàn)的天然套索肽具有抗菌、抗腫瘤、抗HIV等作用；更有意思的是通過(guò)生物合成基因突變方式將整合素（integrins）的三肽識(shí)別序列Arg-Gly-Asp引入到套索肽MccJ25中后，發(fā)現(xiàn)此MccJ25衍生物具有抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞血管形成作用。因此，套索肽本身、或者依托套索肽高穩(wěn)定性的骨架綴合藥用功能分子，在先導(dǎo)藥物開發(fā)方面具有廣闊的空間。
圖1. 套索肽的四類結(jié)構(gòu)示意圖和本研究發(fā)現(xiàn)的新穎套索肽stlassin結(jié)構(gòu)
然而，目前套索肽相關(guān)研究受到了幾個(gè)方面的限制：由于獨(dú)特的三維“套索”結(jié)構(gòu)難以化學(xué)合成，導(dǎo)致無(wú)法像其它肽類化合物那樣用固相多肽合成方法制備化合物庫(kù)；套索肽生物合成基因簇常處于沉默狀態(tài)，限制了天然套索肽分子的大量發(fā)現(xiàn)；另外，雖然有針對(duì)套索肽生物合成基因簇異源表達(dá)（主要在E. coli中）的研究報(bào)道，但此類研究大多數(shù)產(chǎn)生的套索肽產(chǎn)量低，無(wú)法滿足結(jié)構(gòu)修飾和生物活性測(cè)試的要求。
針對(duì)上述問(wèn)題，馬明研究團(tuán)隊(duì)首先從一株海洋鏈霉菌（來(lái)自于團(tuán)隊(duì)所構(gòu)建的海洋細(xì)菌菌種庫(kù)）中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)套索肽生物合成基因簇stla，通過(guò)將stla克隆至鏈霉菌Streptomyces coelicolor A3(2)中進(jìn)行異源表達(dá)，并引入KasOp*啟動(dòng)子激活該基因簇，成功發(fā)現(xiàn)一個(gè)新穎的II型套索肽stlassin，計(jì)算產(chǎn)量可達(dá)20 mg/L?；谠摦愒粗苽淦脚_(tái)，研究團(tuán)隊(duì)對(duì)stlassin生物合成中前體肽中的核心肽（15個(gè)氨基酸殘基）開展了點(diǎn)突變，發(fā)現(xiàn)核心肽中15個(gè)氨基酸位置的突變對(duì)生物合成具有不同的影響；同時(shí)得益于異源制備平臺(tái)的高產(chǎn)量以及生物合成中翻譯后修飾酶對(duì)前體肽突變的容忍性，制備了17個(gè)相應(yīng)的stlassin突變體分子。對(duì)stlassin及其變體分子進(jìn)行了溶液核磁共振結(jié)構(gòu)測(cè)定，確證了它們獨(dú)特的右手螺旋“套索”結(jié)構(gòu)。同時(shí)stlassin及其變體分子顯示了極高的穩(wěn)定性，實(shí)驗(yàn)證實(shí)它們可以對(duì)抗95 °C加熱以及carboxypeptidase Y的酶解。
圖2. Stlassin及其變體分子的溶液核磁共振三維結(jié)構(gòu)
除了利用生物合成前體肽基因突變獲得stlassin變體分子外，研究團(tuán)隊(duì)還結(jié)合近年報(bào)道的蛋白/多肽位點(diǎn)選擇性修飾反應(yīng)，進(jìn)一步擴(kuò)展stlassin類分子結(jié)構(gòu)多樣性。通過(guò)生物合成前體肽基因突變和高產(chǎn)量異源制備平臺(tái)，成功得到了引入酪氨酸或者半胱氨酸殘基的stlassin變體分子。針對(duì)引入的酪氨酸或者半胱氨酸側(cè)鏈活性基團(tuán)進(jìn)行多種溫和條件下的高效修飾反應(yīng)，制備了10個(gè)包含O-糖基化、S-糖基化、S-芳香化、分子內(nèi)二硫鍵、分子間二硫鍵、硫消除及巰基分子加成等修飾的stlassin變體分子。部分變體分子結(jié)構(gòu)已經(jīng)超越了目前對(duì)套索肽的四種分類范圍。值得注意的是這些修飾反應(yīng)彌補(bǔ)了生物合成中相應(yīng)修飾基因缺失的不足，將生物合成制備“套索”骨架與骨架的化學(xué)修飾相結(jié)合，體現(xiàn)了“源于自然，優(yōu)于自然”的天然產(chǎn)物變體分子制備理念。研究團(tuán)隊(duì)最后對(duì)所得stlassin及其變體分子開展了生物活性測(cè)試，發(fā)現(xiàn)它們不同程度的抑制脂多糖（LPS）與Toll-like receptor 4 (TLR4)受體的結(jié)合，表現(xiàn)出抗炎活性的潛力。
圖3. 生物合成和化學(xué)修飾相結(jié)合擴(kuò)展套索肽結(jié)構(gòu)多樣性
該項(xiàng)工作得到科技部重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃“深海關(guān)鍵技術(shù)與裝備”項(xiàng)目“重要深海藥源天然產(chǎn)物合成生物學(xué)產(chǎn)生體系構(gòu)建”、國(guó)家自然科學(xué)基金委等資助。北京大學(xué)藥學(xué)院博士研究生劉談、馬曉杰為本論文共同第一作者，中國(guó)科學(xué)院生物物理研究所蛋白質(zhì)核磁研究平臺(tái)的劉雪輝老師和北京大學(xué)藥學(xué)院馬明研究員為共同通訊作者。同濟(jì)大學(xué)韓華老師及楊文盛同學(xué)在生物活性測(cè)試方面提供了支持。
原文鏈接：https://doi.org/10.1039/D1SC02695J
【通訊作者簡(jiǎn)介】
馬明，北京大學(xué)藥學(xué)院、天然藥物及仿生藥物國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室研究員，博士生導(dǎo)師，Tenure-Track助理教授。研究領(lǐng)域?yàn)樘烊凰幱霉δ芊肿拥纳锖铣?，酶的三維結(jié)構(gòu)及其催化機(jī)制，以及天然產(chǎn)物合成生物學(xué)。近5年以通訊作者在JACS、Chem. Sci.、Org. Lett.、J. Biol. Chem.、J. Org. Chem.、J. Nat. Prod.、Chin. J. Chem.、Appl. Microbiol. Biotechnol.、ACS Omega、Mar. Drug等國(guó)際學(xué)術(shù)期刊發(fā)表論文十余篇。任中國(guó)藥學(xué)會(huì)海洋藥物專業(yè)委員會(huì)委員、中華中醫(yī)藥學(xué)會(huì)青年委員會(huì)委員、北京藥學(xué)會(huì)天然藥物專業(yè)委員會(huì)委員。
天然藥物及仿生藥物國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 供稿
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