Nature Protocols發(fā)表我院劉震教授團(tuán)隊(duì)的單細(xì)胞分析方法
2021年6月5日，?Nature子刊Nature Protocols在線發(fā)表了我院劉震教授團(tuán)隊(duì)在單細(xì)胞低拷貝數(shù)蛋白質(zhì)分析的重要研究工作“Probing low-copy-number proteins in single living cells using single-cell plasmonic immunosandwich assays” （https://doi.org/10.1038/s41596-021-00547-9）。
細(xì)胞是生物體結(jié)構(gòu)和生命活動(dòng)的基本單位，基于細(xì)胞的研究是生命科學(xué)的基礎(chǔ)。然而，由于細(xì)胞體積極小，一些重要組分含量極低，細(xì)胞微環(huán)境的復(fù)雜性等等因素使得單細(xì)胞分析成為一項(xiàng)十分具有挑戰(zhàn)性的工作。通常的生命科學(xué)研究主要以大量細(xì)胞為研究對(duì)象，但是，這種細(xì)胞群體水平的分析掩蓋了細(xì)胞個(gè)體間存在的顯著微觀不均一性，因而難以反映出單細(xì)胞水平真實(shí)的生命活動(dòng)規(guī)律。因此，基于單細(xì)胞分析的生命科學(xué)研究能夠從更深的層次上揭示生命活動(dòng)的本質(zhì)和規(guī)律，為探究重大疾病的起因、發(fā)展和治療提供更可靠的科學(xué)依據(jù)。
蛋白質(zhì)是生物學(xué)功能的直接執(zhí)行分子，近年來，越來越多的研究表明除了基因突變外，蛋白質(zhì)的異常也與癌癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。低拷貝數(shù)蛋白質(zhì)，是指在單個(gè)細(xì)胞內(nèi)分子數(shù)目少于1000個(gè)拷貝數(shù)的蛋白質(zhì)，雖然這些蛋白質(zhì)的豐度極低，但是它們?cè)诙喾N重要的生物學(xué)過程中起著關(guān)鍵的調(diào)控作用?？v觀整個(gè)單細(xì)胞分析技術(shù)領(lǐng)域，蛋白質(zhì)的分析手段遠(yuǎn)遠(yuǎn)滯后于基因組和轉(zhuǎn)錄組的分析方法，其最根本的原因是蛋白質(zhì)的研究缺少類似于PCR的擴(kuò)增工具，導(dǎo)致很多低豐度的蛋白質(zhì)在檢測(cè)方面巨大的挑戰(zhàn)。因此，發(fā)展適用于單細(xì)胞內(nèi)低拷貝數(shù)蛋白質(zhì)的檢測(cè)技術(shù)具有重要的科學(xué)意義和應(yīng)用價(jià)值。
我院劉震教授團(tuán)隊(duì)將免疫識(shí)別與等離激元拉曼檢測(cè)技術(shù)相結(jié)合，創(chuàng)新性地發(fā)展了一種等離激元免疫夾心法（Plasmonic immunosandwich assays, PISA），成功實(shí)現(xiàn)了單個(gè)活細(xì)胞及活體動(dòng)物內(nèi)多種低拷貝數(shù)蛋白質(zhì)的分析（Angewandte Chemie International Edition, 2016, 55, 13215）。此后，該方法還擴(kuò)展到單個(gè)活細(xì)胞中的microRNA的分析（Chemical Science, 2018, 9, 7241）以及基于生理樣品中的蛋白質(zhì)和microRNA標(biāo)志物的疾病診斷分析（Analytical Chemistry, 2016, 88, 12363；Analytical Chemistry, 2019, 2019, 91, 4831；Analytical Chemistry, 2019, 91, 9993；Biosensors and Bioelectronics, 2019, 145, 111729）。同時(shí)，該技術(shù)還被成功應(yīng)用于單細(xì)胞信號(hào)通路研究和抗癌藥物活性評(píng)價(jià)（Analytical Chemistry, 2020, 92, 12498）等應(yīng)用。單細(xì)胞等離激元免疫夾心法（scPISA）的工作流程示意圖如圖1所示。該方法的原理為：親和配基功能化的金基微萃取探針（尖端約0.5-1微米）在顯微操作系統(tǒng)的控制下，準(zhǔn)確地插入單個(gè)活細(xì)胞內(nèi)特定部位進(jìn)行目標(biāo)蛋白的富集，萃取一定的時(shí)間后，將微萃取探針從細(xì)胞內(nèi)拔出，經(jīng)過適當(dāng)?shù)那逑床襟E降低微萃取探針表面的非特異性吸附，再用親和配基功能化的銀基納米拉曼標(biāo)簽對(duì)富集到的目標(biāo)蛋白質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記，從而在微萃取探針表面形成類似三明治夾心結(jié)構(gòu)的微萃取探針-目標(biāo)蛋白質(zhì)-納米拉曼標(biāo)簽免疫復(fù)合物，當(dāng)激光照射在該免疫復(fù)合物的表面，金基微萃取探針和銀基納米拉曼標(biāo)簽之間納米級(jí)間隙內(nèi)由于等離激元耦合作用產(chǎn)生 “熱點(diǎn)”，顯著地增強(qiáng)納米標(biāo)簽的表面增強(qiáng)拉曼散射（SERS）信號(hào)，靈敏度達(dá)單分子水平，從而能夠?qū)崿F(xiàn)低拷貝數(shù)生物分子的檢測(cè)。另一方面，基于抗體或人工抗體（包括分子印跡聚合物和核酸適配體）的免疫微萃取以及免疫三明治夾心復(fù)合物的技術(shù)路徑充分能保證檢測(cè)的專一性。
圖1. 單細(xì)胞等離激元免疫夾心法的工作示意圖
圖2. 該方法所用的儀器平臺(tái)
與現(xiàn)有的單細(xì)胞蛋白質(zhì)分析技術(shù)相比，scPISA具有以下明顯的優(yōu)勢(shì)：首先，超高的檢測(cè)靈敏度（單分子水平），實(shí)現(xiàn)低豐度生物分子的檢測(cè)；其次，對(duì)目標(biāo)蛋白質(zhì)識(shí)別的高特異性，保證方法可以應(yīng)用于復(fù)雜的細(xì)胞微環(huán)境；第三，分析速度快，從活體萃取到拉曼信號(hào)的讀出僅需要約6-15分鐘；scPISA是一項(xiàng)微創(chuàng)的技術(shù)，經(jīng)過萃取后細(xì)胞仍能存活，可以繼續(xù)用于后續(xù)研究，該特點(diǎn)在發(fā)育生物學(xué)及精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用價(jià)值。此外，scPISA還具有普適性，除了用于蛋白質(zhì)的分析，還可以用于核酸等其他生物物種的分析，只需要選擇相應(yīng)的親和配基制備具有靶向識(shí)別性能的功能化微探針和納米標(biāo)記標(biāo)簽即可。
通過單細(xì)胞等離激元免疫夾心法，研究人員獲得了單個(gè)活細(xì)胞中多種低拷貝數(shù)蛋白質(zhì)的諸多重要分子信息，例如低拷貝數(shù)蛋白質(zhì)在單細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)水平、亞細(xì)胞分布等等。這些關(guān)鍵信息不僅從分子水平揭示了細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)表達(dá)和分布的異質(zhì)性，也為多種生物學(xué)過程以及蛋白相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展提供了重要信息。在此基礎(chǔ)上，該團(tuán)隊(duì)將該技術(shù)應(yīng)用于單細(xì)胞信號(hào)通路研究，建立了具有亞細(xì)胞分辨率的關(guān)鍵信號(hào)蛋白及其復(fù)合物的測(cè)定和多元檢測(cè)等方法。該方法有望信號(hào)通路研究、為精準(zhǔn)藥效評(píng)價(jià)和個(gè)性化藥物篩選等重要應(yīng)用領(lǐng)域提供新穎可靠的研究手段。
該論文的第一作者是劉佳博士，劉震教授為論文的通訊作者。賀暉、謝丹和溫艷蓉為共同作者。該工作得到國(guó)家自然科學(xué)基金重大科研儀器研制項(xiàng)目和南京大學(xué)卓越計(jì)劃的資助。
?
論文信息：
https://www.nature.com/articles/s41596-021-00547-9
Probing low-copy-number proteins in single living cells using single-cell plasmonic immunosandwich assays
Jia Liu, Hui He, Dan Xie, Yanrong Wen, Zhen Liu*
Nature Protocols, 2021, DOI:https://doi.org/10.1038/s41596-021-00547-9
版權(quán)與免責(zé)聲明：本網(wǎng)頁的內(nèi)容由收集互聯(lián)網(wǎng)上公開發(fā)布的信息整理獲得。目的在于傳遞信息及分享，并不意味著贊同其觀點(diǎn)或證實(shí)其真實(shí)性，也不構(gòu)成其他建議。僅提供交流平臺(tái)，不為其版權(quán)負(fù)責(zé)。如涉及侵權(quán)，請(qǐng)聯(lián)系我們及時(shí)修改或刪除。郵箱：sales@allpeptide.com