清華大學(xué)陳春來(lái)和劉俊杰課題組共同揭示spCas9蛋白搜索靶點(diǎn)的分子機(jī)制模型
CIRSPR/Cas9是一種在單條guide RNA（gRNA）的指導(dǎo)下利用Cas9核酸酶對(duì)靶標(biāo)DNA進(jìn)行特異性識(shí)別和切割的技術(shù)。該過程涉及到Cas9/gRNA與雙鏈DNA（dsDNA）非特異性的結(jié)合、在dsDNA上搜索并識(shí)別PAM位點(diǎn)、通過與PAM上游的同源匹配形成RNA/DNA異源雙鏈從而實(shí)現(xiàn)在dsDNA上靶點(diǎn)區(qū)域的特異性結(jié)合和切割。由于Cas9可以高效快捷地靶向并切割dsDNA，因而被廣泛地應(yīng)用于基因編輯、基因表達(dá)調(diào)控、基因定位和成像等領(lǐng)域。但是，Cas9如何在大量DNA中快速定位其靶標(biāo)尚不清楚。盡管有研究報(bào)道了Cas9在低鹽濃度下利用三維和一維擴(kuò)散模式搜索靶點(diǎn)，但缺乏闡釋其在生理鹽濃度下靶標(biāo)搜尋這一動(dòng)態(tài)過程的結(jié)構(gòu)生物學(xué)基礎(chǔ)和分子定量模型。
2021年8月20日，清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院陳春來(lái)和劉俊杰課題組合作在《化學(xué)科學(xué)》（Chemical Science）雜志發(fā)表了題目為“spCas9與PAM下游DNA位點(diǎn)的非特異性相互作用加速其靶點(diǎn)搜索過程（Nonspecific interactions between SpCas9 and dsDNA sites located downstream of the PAM mediate facilitated diffusion to accelerate target search）” 的研究論文。該論文揭示了在生理鹽濃度下，spCas9利用三維和一維擴(kuò)散實(shí)現(xiàn)高效搜索靶點(diǎn)，其1151-1156位的賴氨酸殘基與PAM下游 ~ 8 bp DNA位點(diǎn)的非特異性結(jié)合是介導(dǎo)一維擴(kuò)散并造成PAM側(cè)翼不對(duì)稱一維搜索的主要原因。該文揭示了spCas9在生理鹽濃度下的獨(dú)特搜索靶點(diǎn)機(jī)制和相應(yīng)的結(jié)構(gòu)生物學(xué)基礎(chǔ)，為Cas9體內(nèi)和體外的應(yīng)用提供了重要指導(dǎo)。
結(jié)合生化實(shí)驗(yàn)與單分子熒光技術(shù)，該研究發(fā)現(xiàn)，在生理鹽濃度下，spCas9利用三維和一維擴(kuò)散實(shí)現(xiàn)快速搜尋靶點(diǎn)。spCas9的一維擴(kuò)散以PAM位點(diǎn)為中心展現(xiàn)出了不對(duì)稱的搜索區(qū)域（從PAM上游 ~ 10 bp到PAM下游 ~ 30 bp），將靶標(biāo)搜索效率提高了10倍以上。同時(shí)，結(jié)合Cas9/gRNA/DNA二聚體的單顆粒冷凍電鏡結(jié)構(gòu)和單分子熒光實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步揭示，PAM下游的~ 8 bp DNA位點(diǎn)與Cas9的1151-1156位賴氨酸殘基（尤其是1153位賴氨酸）之間的存在緊密的非特異性相互作用，是介導(dǎo)Cas9一維擴(kuò)散并導(dǎo)致PAM側(cè)翼的不對(duì)稱搜索區(qū)域的主要原因。而通過改變Cas9與DNA的相互作用，包括突變1151-1156位賴氨酸殘基、降低緩沖體系的鹽濃度以及改變PAM識(shí)別殘基，都會(huì)影響其一維擴(kuò)散的過程。
最后，該研究提出了spCas9搜索靶點(diǎn)的詳細(xì)分子模型（圖1）：在生理鹽濃度下，溶液中自由擴(kuò)散的Cas9/gRNA復(fù)合物通過三維隨機(jī)碰撞與dsDNA相互作用。一旦通過1151-1156位賴氨酸殘基與dsDNA非特異性相互作用，spCas9就會(huì)瞬時(shí)結(jié)合并沿dsDNA雙螺旋進(jìn)行~ 20 bp的一維擴(kuò)散以尋找PAM位點(diǎn)。一旦搜索到同源靶標(biāo)就會(huì)結(jié)合形成復(fù)合物，否則會(huì)被釋放進(jìn)入溶液并重新進(jìn)入搜索過程。spCas9通過與PAM下游區(qū)域的非特異性結(jié)合使靶標(biāo)搜索速率提高了10倍以上，該研究為spCas9 的靶標(biāo)位點(diǎn)設(shè)計(jì)提供了重要指導(dǎo)。
清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院陳春來(lái)研究員與劉俊杰研究員為本文共同通訊作者。清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院CLS項(xiàng)目已畢業(yè)博士生楊夢(mèng)銥（現(xiàn)為首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京兒童醫(yī)院營(yíng)養(yǎng)與發(fā)育研究室研究實(shí)習(xí)員）為本文第一作者。生命學(xué)院17級(jí)博士生孫瑞瑞、結(jié)構(gòu)生物學(xué)高精尖創(chuàng)新中心卓越學(xué)者鄧譜涓, 醫(yī)學(xué)院CLS項(xiàng)目17級(jí)博士生楊宇卓、王文娟高級(jí)工程師參與了本項(xiàng)目研究。本工作獲得了北京結(jié)構(gòu)生物學(xué)高精尖創(chuàng)新中心、北京市生物結(jié)構(gòu)前沿研究中心、清華-北大生命科學(xué)聯(lián)合中心及國(guó)家自然科學(xué)基金委的經(jīng)費(fèi)支持。
論文鏈接：
https://doi.org/10.1039/D1SC02633J
課題組相關(guān)論文鏈接：
https://doi.org/10.1073/pnas.2002971117
https://doi.org/10.1016/j.isci.2019.08.005
https://doi.org/10.1016/j.celrep.2017.12.048
圖1. spCas9蛋白搜索靶標(biāo)DNA的分子機(jī)制模型
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