最新研究成果 | 新冠病毒變種傳播力緣何增強(qiáng) | 清華大學(xué)藥學(xué)院譚旭課題組及合作者揭示新冠流行變種具有逃逸人體細(xì)胞免疫的普遍特點(diǎn)
時(shí)間：2021-09-01 10:42:01學(xué)院：藥學(xué)院學(xué)校：清華大學(xué)
新冠病毒自2019年12月以來(lái)，已經(jīng)蔓延到了全球223個(gè)國(guó)家，感染人數(shù)超過(guò)2.1億，死亡人數(shù)超過(guò)444萬(wàn)，成為自1918年流感大流行以來(lái)全球最大的健康危機(jī)。特別是近期受到廣泛關(guān)注的德?tīng)査兎N，平均能夠傳染8-9個(gè)人，傳播能力大幅度提高，而且德?tīng)査兎N的感染往往伴隨更加嚴(yán)重的新冠肺炎臨床癥狀，為疫情防控帶來(lái)了巨大的挑戰(zhàn)。
?新冠病毒的變種為什么能夠具有這么強(qiáng)的傳染能力呢？為了解釋這一原因，清華大學(xué)藥學(xué)院譚旭實(shí)驗(yàn)室和中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院金騰川實(shí)驗(yàn)室從細(xì)胞免疫的角度出發(fā)，通過(guò)高通量篩選的方法鑒定了新冠病毒特異性CD8+ T 細(xì)胞的抗原識(shí)別表位，并找到了新冠病毒變種逃逸細(xì)胞免疫的證據(jù)，為后續(xù)疫苗的設(shè)計(jì)和優(yōu)化提供了新的思路。相關(guān)論文近日于國(guó)際一流期刊《Cell Reports》發(fā)表。
新冠病毒變種的命名
新冠病毒德?tīng)査兎N的命名來(lái)自于CDC和WHO的分類系統(tǒng)，由于新冠病毒在傳播過(guò)程中在不斷地變異，為了更好地定義新冠病毒的變種， CDC和WHO獨(dú)立建立了一個(gè)分類系統(tǒng)，將新冠病毒的變異體分為關(guān)注變種 (Variants of concern) 和待關(guān)注變種 (Variants of interest)。
關(guān)注變種的特點(diǎn)是：
（1）具有更高的傳染性，即可以感染更多的人群
（2）誘發(fā)更嚴(yán)重的疾病 (即住院或死亡人數(shù)增加)
（3）降低治療和疫苗的有效性
（4）可能逃避診斷檢測(cè)
關(guān)注變種一共包括四種變異體：
阿爾法變種(B.1.1.7)，貝塔變種 (B.1.351)，伽馬變種 (P.1)，德?tīng)査兎N (B.1.617.2)?
待關(guān)注變種被認(rèn)為是危險(xiǎn)性較低的關(guān)注變種，WHO于2021 年 6 月 22 日更新了待關(guān)注變種的名單，包括7個(gè)變異體：
Epsilon (B.1.427 和 B.1.429)，Zeta (P.2)， Eta(B.1.525)，Xita (P.3)，Iota (B.1.526)，Kappa (B.1.617.1) 和最近廣受關(guān)注的拉姆達(dá)(C.37)。
新冠病毒變種的傳播
全球流感共享數(shù)據(jù)庫(kù)(GISAID) 總結(jié)了2021年所有在官網(wǎng)提交的新冠病毒序列的比例匯總?(圖2)，可以看到新冠病毒變種在全球感染范圍的動(dòng)態(tài)變化。
從圖2可以看到，2021年1月起， 阿爾法變種首先占據(jù)傳播優(yōu)勢(shì)。然而從5月開(kāi)始，德?tīng)査兎N逐漸代替阿爾法變種，成為在全球傳播的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)變種。德?tīng)査兎N是在2020年10月首次在印度馬哈拉施特拉邦被發(fā)現(xiàn)的。隨后在 2020 年末僅用2個(gè)月的時(shí)間傳播到整個(gè)印度，并超越了在印度傳播的原有的73 個(gè)譜系，可見(jiàn)傳播能力之強(qiáng) 。至今德?tīng)査兎N已經(jīng)傳播到了200多個(gè)國(guó)家，是目前最值得關(guān)注的變種。
?新冠病毒變種優(yōu)勢(shì)建立的研究及細(xì)胞免疫應(yīng)答的重要性
新冠病毒變種的優(yōu)勢(shì)建立和病毒的感染能力、免疫逃逸能力、傳播能力等方面都有關(guān)系。
感染能力
以德?tīng)査兎N為例，已有研究報(bào)道，與?阿爾法變種 相比，德?tīng)査兎N的S蛋白能夠更加高效地被宿主細(xì)胞蛋白酶切割形成具有功能的蛋白，在類器官水平上極大提高了德?tīng)査兎N入侵細(xì)胞的效率， 也加快了德?tīng)査兎N在感染初期的復(fù)制速度，為德?tīng)査兎N優(yōu)勢(shì)建立提供了思路 (Mlcochova et al., 2021)。
免疫逃逸能力
除了感染能力的提高，關(guān)注變種也增強(qiáng)了免疫逃逸能力，以德?tīng)査兎N為例：
和野生型新冠病毒相比，新冠病毒康復(fù)者血清中和抗體對(duì)德?tīng)査兎N的中和能力平均下降6倍；
疫苗?(ChAdOx-1和BNT162b2) 對(duì)德?tīng)査兎N的防護(hù)效果平均下降8倍；
臨床批準(zhǔn)的用于治療新冠病毒相關(guān)疾病的單克隆抗體bamlavinimab 和imdevimab 對(duì)德?tīng)査兎N的中和能力分別下降1000倍和50倍 (Mlcochova et al., 2021)。
雖然關(guān)注變種對(duì)抗體介導(dǎo)的體液免疫敏感度下降，但由于關(guān)注變種在傳播過(guò)程中絕大部分人都是初次感染，體內(nèi)并沒(méi)有中和抗體，因此對(duì)已知抗體的反應(yīng)較弱能夠提示我們現(xiàn)有疫苗對(duì)于這些變種的保護(hù)性會(huì)有所下降，但不能完全解釋關(guān)注變種的大規(guī)模傳播。此外根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，德?tīng)査兎N對(duì)康復(fù)血清或疫苗后血清的中和抗體敏感性下降程度和貝塔變種(B.1.315) 接近，但傳播程度卻遠(yuǎn)超貝塔變種 (Plante et al., 2021)，這提示除了體液免疫之外，CD8+ T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答的逃逸也可能促進(jìn)了新冠病毒優(yōu)勢(shì)變種的不斷傳播。先前的研究已經(jīng)表明，細(xì)胞免疫的應(yīng)答不僅與新冠病情的輕重發(fā)展具有相關(guān)性 (Sette and Crotty, 2021)，特別地，新冠病毒特異性CD8+ T細(xì)胞早于中和抗體被檢測(cè)到，說(shuō)明細(xì)胞免疫應(yīng)答在病毒感染早期就開(kāi)始發(fā)揮作用，而這種早期的免疫抑制對(duì)于機(jī)體防御新冠病毒、抑制新冠病毒的傳播可能是非常重要的。此外，對(duì)2003年SARS康復(fù)患者的長(zhǎng)期研究表明，細(xì)胞免疫保持的時(shí)間長(zhǎng)度很長(zhǎng)，有的甚至能長(zhǎng)達(dá)17年(Le Bert et al., 2020)，而相對(duì)而言，康復(fù)患者的抗體免疫記憶則要短很多。系統(tǒng)地了解新冠病毒感染者特別是康復(fù)患者的細(xì)胞免疫應(yīng)答，對(duì)于我們了解病人的病情發(fā)展的免疫決定因素，幫助新型疫苗設(shè)計(jì)甚至預(yù)測(cè)病人對(duì)疫苗的反應(yīng)，都有重要意義。
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T-Scan技術(shù)篩選新冠病毒
特異性CD8+ T細(xì)胞抗原表位
探究細(xì)胞免疫應(yīng)答的重要步驟就是鑒定新冠病毒特異性CD8+ T細(xì)胞的抗原識(shí)別表位。清華大學(xué)譚旭課題組運(yùn)用T-Scan技術(shù)，研究了能夠引起人體CD8 T 細(xì)胞響應(yīng)的新冠病毒抗原表位的分布，并發(fā)現(xiàn)了新冠基因組上的4個(gè)氨基酸位點(diǎn)的突變可能賦予關(guān)注變種逃逸細(xì)胞免疫的能力從而促進(jìn)病毒的傳播，為關(guān)注變種的防范提供了細(xì)胞免疫方向的基礎(chǔ)? (圖1)。
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T-Scan技術(shù)是2019年由美國(guó)哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院Stephen Elledge教授發(fā)明的用于識(shí)別 T 細(xì)胞抗原的高通量篩選平臺(tái) (Kula et al., 2019)。運(yùn)用T-Scan技術(shù)構(gòu)建新冠病毒抗原呈遞的靶細(xì)胞文庫(kù)的原理如圖1所示。首先運(yùn)用DNA芯片大規(guī)模合成技術(shù)，合成覆蓋新冠病毒編碼的所有蛋白的多肽基因序列 ，每個(gè)多肽56氨基酸，一共有9179條序列。之后使用慢病毒載體將新冠病毒多肽抗原的基因文庫(kù)轉(zhuǎn)達(dá)到靶細(xì)胞中，在靶細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行多肽抗原基因的表達(dá)和多肽抗原的內(nèi)源性加工最終由靶細(xì)胞的主要組織相容性復(fù)合體 (MHC) 分子將新冠病毒抗原呈遞到細(xì)胞表面，較好地模擬了細(xì)胞被病毒感染后將病毒抗原呈遞到細(xì)胞表面的過(guò)程。此外，靶細(xì)胞還攜帶響應(yīng)顆粒酶 B（Granzyme B, GzB）活性的IFP熒光報(bào)告基因(圖3)，用于篩選被CD8+ T細(xì)胞識(shí)別的靶細(xì)胞。GzB是一種絲氨酸蛋白酶，平時(shí)儲(chǔ)存在CD8+ T細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞毒性顆粒中，當(dāng)CD8+ T細(xì)胞識(shí)別靶細(xì)胞呈遞的病毒抗原后被活化，CD8+ T開(kāi)始執(zhí)行殺傷功能，通過(guò)穿孔素在細(xì)胞膜上形成孔洞將裝載GzB的細(xì)胞毒性顆粒特異性分泌到靶細(xì)胞中。GzB進(jìn)入靶細(xì)胞后激活I(lǐng)FP熒光報(bào)告基因。接下來(lái)可以通過(guò)流式篩選富集被識(shí)別的靶細(xì)胞，并通過(guò)下一代測(cè)序鑒定靶細(xì)胞呈遞的抗原序列。
CD8+ T細(xì)胞的識(shí)別具有MHC-I類分子限制性，只能識(shí)別和自身MHC基因型匹配的MHC分子所呈遞的抗原。MHC-I類分子包括A,B,C三種基因型，稱為HLA-A、HLA-B和HLA-C，每一種基因型又包括了多種等位基因，因此MHC分子的多樣性非常豐富。作者選取了中國(guó)人群中頻率最高的四種HLA-A基因型進(jìn)行研究，包括HLA-A*02:01、HLA-A*02:07、HLA-A*11:01 和 HLA-A*24:02（分別以占中國(guó)人口的 10.9%、9.2% 、21.4%和14.4% ，http://www.allelefrequencies.net/default.asp)。
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作者構(gòu)建了過(guò)表達(dá)HLA-A*02:01、HLA-A*02:07、HLA-A*11:01 或HLA-A*24:02的靶細(xì)胞文庫(kù)來(lái)呈遞新冠病毒的抗原表位。在檢測(cè)了新冠病毒康復(fù)者的HLA-A基因型之后，將基因型匹配的靶細(xì)胞文庫(kù)和新冠病毒康復(fù)者的CD8 + T細(xì)胞進(jìn)行孵育，從涵蓋了上述四個(gè)HLA基因型的10個(gè)新冠病毒康復(fù)者的PBMC中分離了記憶性CD8+ T細(xì)胞進(jìn)行T-Scan篩選，共篩選到70條潛在的新冠病毒特異性CD8+ T細(xì)胞抗原識(shí)別表位，顯著富集了新冠病毒ORF1a、ORF1b 和 S蛋白的多肽片段，說(shuō)明這三個(gè)基因可能是CD8+ T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫的重要抗原來(lái)源。
保守性CD8+ T細(xì)胞抗原表位的鑒定
圖4:?保守性CD8+ T細(xì)胞抗原表位
攜帶關(guān)注變種突變的CD8+ T細(xì)胞抗原表位的鑒定
新冠病毒的S蛋白介導(dǎo)病毒進(jìn)入細(xì)胞，是中和抗體的主要識(shí)別靶點(diǎn)，S蛋白上的突變被證實(shí)能夠?qū)е虏《咎右葜泻涂贵w，也因此最為受到關(guān)注。圖5列出了4種關(guān)注變種的起源以及其在新冠病毒S蛋白上的突變位點(diǎn)。
?圖5: 新冠病毒的4種全球關(guān)注變種（關(guān)注變種）及其所攜帶的氨基酸突變位點(diǎn)
關(guān)注變種突變破壞HLA分子呈遞CD8+ T細(xì)胞抗原表位的結(jié)構(gòu)機(jī)制
更近一步，金騰川教授課題組通過(guò)晶體學(xué)的方法，解析了其中2條抗原表位和對(duì)應(yīng)MHC分子的復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)?(圖7)?？梢郧逦乜吹皆贙IA-HLA-A*02:01復(fù)合物（圖7A）中，417位的賴氨酸的正電荷側(cè)鏈與HLA-A*02:01蛋白的W167通過(guò)Pi陽(yáng)離子相互作用牢牢結(jié)合，貝塔變種和伽馬變種攜帶的K417N/T突變將打破這一相互作用，導(dǎo)致HLA-A*02:01蛋白無(wú)法識(shí)別這一抗原表位，作者也通過(guò)生化的方法證明了這一結(jié)論。在NYN-HLA-A*24:02復(fù)合物（圖7B）中，452位的亮氨酸的疏水側(cè)鏈埋在了HLA-A*24:02蛋白表面的疏水口袋中，通過(guò)疏水相互作用緊密結(jié)合，關(guān)鍵位點(diǎn)452位氨基酸的突變可能幫助病毒逃逸抗原表位NYN介導(dǎo)的細(xì)胞免疫。
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?以德?tīng)査兎N為例，德?tīng)査兎N攜帶的L452R的突變將引入帶正電荷的精氨酸R，完全破壞了原有的疏水相互作用，進(jìn)而破壞NYN抗原表位的呈遞。2021年7月Motozono 等人在Cell Host & Microbe雜志上報(bào)道了L452R介導(dǎo)新冠病毒的細(xì)胞免疫逃逸 (Motozono et al., 2021)，這篇研究也為此進(jìn)一步提供了結(jié)構(gòu)學(xué)基礎(chǔ)。
總結(jié)
新冠病毒關(guān)注變種對(duì)免疫系統(tǒng)的逃逸大大增加了全球疫苗接種計(jì)劃的復(fù)雜度，了解關(guān)注變種免疫逃逸機(jī)制對(duì)未來(lái)疫苗的設(shè)計(jì)具有重要意義。先前的研究證實(shí)了HIV的進(jìn)化動(dòng)力之一就是通過(guò)突變CD8+ T細(xì)胞識(shí)別的抗原表位來(lái)達(dá)到逃逸細(xì)胞免疫的目的 (Allen et al., 2005; Kawashima et al., 2009; Moore et al., 2002)。這篇文章中，作者通過(guò)T-Scan技術(shù)篩選并鑒定了4條新冠病毒特異性CD8+ T細(xì)胞識(shí)別的關(guān)鍵性抗原表位，而新冠病毒關(guān)注變種（阿爾法, 貝塔, 伽馬 和德?tīng)査┲辽偻蛔兞似渲幸粭l關(guān)鍵性抗原表位，揭示了逃逸人體細(xì)胞免疫是新冠流行變種的普遍特點(diǎn)。除此之外，作者篩選到的冠狀病毒保守性抗原表位，也為后續(xù)的冠狀病毒的通用疫苗設(shè)計(jì)提供了理論基礎(chǔ)。
清華大學(xué)藥學(xué)院博士生張航和中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)生命科學(xué)與醫(yī)學(xué)部博士生鄧莎莎為本文共同一作，譚旭教授和金騰川教授為本文共同通訊作者。該研究受到了國(guó)家自然科學(xué)基金委，清華大學(xué)春風(fēng)基金以及中科院先導(dǎo)項(xiàng)目的資助。清華大學(xué)董晨實(shí)驗(yàn)室，林欣實(shí)驗(yàn)室和石彥實(shí)驗(yàn)室為本項(xiàng)目提供了大力幫助。
原文鏈接：https://www.cell.com/cell-reports/fulltext/S2211-1247(21)01155-4
參考文獻(xiàn)
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Kawashima, Y., Pfafferott, K., Frater, J., Matthews, P., Payne, R., Addo, M., Gatanaga, H., Fujiwara, M., Hachiya, A., Koizumi, H., et al. (2009). Adaptation of HIV-1 to human leukocyte antigen class I. Nature 458, 641-645.
Kula, T., Dezfulian, M.H., Wang, C.I., Abdelfattah, N.S., Hartman, Z.C., Wucherpfennig, K.W., Lyerly, H.K., and Elledge, S.J. (2019). T-Scan: A Genome-wide Method for the Systematic Discovery of T Cell Epitopes. Cell 178, 1016-1028.e1013.
Le Bert, N., Tan, A.T., Kunasegaran, K., Tham, C.Y.L., Hafezi, M., Chia, A., Chng, M.H.Y., Lin, M., Tan, N., Linster, M., et al. (2020). SARS-CoV-2-specific T cell immunity in cases of COVID-19 and SARS, and uninfected controls. Nature 584, 457-462.
Mlcochova, P., Kemp, S., Dhar, M.S., Papa, G., Meng, B., Mishra, S., Whittaker, C., Mellan, T., Ferreira, I., Datir, R., et al. (2021).
Moore, C.B., John, M., James, I.R., Christiansen, F.T., Witt, C.S., and Mallal, S.A. (2002). Evidence of HIV-1 adaptation to HLA-restricted immune responses at a population level. Science (New York, NY) 296, 1439-1443.
Motozono, C., Toyoda, M., Zahradnik, J., Saito, A., Nasser, H., Tan, T.S., Ngare, I., Kimura, I., Uriu, K., Kosugi, Y., et al. (2021). SARS-CoV-2 spike L452R variant evades cellular immunity and increases infectivity. Cell host & microbe.
Plante, J.A., Mitchell, B.M., Plante, K.S., Debbink, K., Weaver, S.C., and Menachery, V.D. (2021). The variant gambit: COVID-19's next move. Cell host & microbe 29, 508-515.
Sette, A., and Crotty, S. (2021). Adaptive immunity to SARS-CoV-2 and COVID-19. Cell 184, 861-880.
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圖1：新冠病毒特異性CD8+ T細(xì)胞抗原表位的鑒定
圖1：新冠病毒特異性CD8+ T細(xì)胞抗原表位的鑒定
?新冠病毒的變種為什么能夠具有這么強(qiáng)的傳染能力呢？為了解釋這一原因，清華大學(xué)藥學(xué)院譚旭實(shí)驗(yàn)室和中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院金騰川實(shí)驗(yàn)室從細(xì)胞免疫的角度出發(fā)，通過(guò)高通量篩選的方法鑒定了新冠病毒特異性CD8+ T 細(xì)胞的抗原識(shí)別表位，并找到了新冠病毒變種逃逸細(xì)胞免疫的證據(jù)，為后續(xù)疫苗的設(shè)計(jì)和優(yōu)化提供了新的思路。相關(guān)論文近日于國(guó)際一流期刊《Cell Reports》發(fā)表。
新冠病毒變種的命名
新冠病毒德?tīng)査兎N的命名來(lái)自于CDC和WHO的分類系統(tǒng)，由于新冠病毒在傳播過(guò)程中在不斷地變異，為了更好地定義新冠病毒的變種， CDC和WHO獨(dú)立建立了一個(gè)分類系統(tǒng)，將新冠病毒的變異體分為關(guān)注變種 (Variants of concern) 和待關(guān)注變種 (Variants of interest)。
關(guān)注變種的特點(diǎn)是：
（1）具有更高的傳染性，即可以感染更多的人群
（2）誘發(fā)更嚴(yán)重的疾病 (即住院或死亡人數(shù)增加)
（3）降低治療和疫苗的有效性
（4）可能逃避診斷檢測(cè)
關(guān)注變種一共包括四種變異體：
阿爾法變種(B.1.1.7)，貝塔變種 (B.1.351)，伽馬變種 (P.1)，德?tīng)査兎N (B.1.617.2)?
待關(guān)注變種被認(rèn)為是危險(xiǎn)性較低的關(guān)注變種，WHO于2021 年 6 月 22 日更新了待關(guān)注變種的名單，包括7個(gè)變異體：
Epsilon (B.1.427 和 B.1.429)，Zeta (P.2)， Eta(B.1.525)，Xita (P.3)，Iota (B.1.526)，Kappa (B.1.617.1) 和最近廣受關(guān)注的拉姆達(dá)(C.37)。
新冠病毒變種的傳播
全球流感共享數(shù)據(jù)庫(kù)(GISAID) 總結(jié)了2021年所有在官網(wǎng)提交的新冠病毒序列的比例匯總?(圖2)，可以看到新冠病毒變種在全球感染范圍的動(dòng)態(tài)變化。
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圖2: 全球流感共享數(shù)據(jù)庫(kù)（GISAID）官網(wǎng)收錄新冠病毒序列比例統(tǒng)計(jì)
圖2: 全球流感共享數(shù)據(jù)庫(kù)（GISAID）官網(wǎng)收錄新冠病毒序列比例統(tǒng)計(jì)
從圖2可以看到，2021年1月起， 阿爾法變種首先占據(jù)傳播優(yōu)勢(shì)。然而從5月開(kāi)始，德?tīng)査兎N逐漸代替阿爾法變種，成為在全球傳播的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)變種。德?tīng)査兎N是在2020年10月首次在印度馬哈拉施特拉邦被發(fā)現(xiàn)的。隨后在 2020 年末僅用2個(gè)月的時(shí)間傳播到整個(gè)印度，并超越了在印度傳播的原有的73 個(gè)譜系，可見(jiàn)傳播能力之強(qiáng) 。至今德?tīng)査兎N已經(jīng)傳播到了200多個(gè)國(guó)家，是目前最值得關(guān)注的變種。
?新冠病毒變種優(yōu)勢(shì)建立的研究及細(xì)胞免疫應(yīng)答的重要性
新冠病毒變種的優(yōu)勢(shì)建立和病毒的感染能力、免疫逃逸能力、傳播能力等方面都有關(guān)系。
感染能力
以德?tīng)査兎N為例，已有研究報(bào)道，與?阿爾法變種 相比，德?tīng)査兎N的S蛋白能夠更加高效地被宿主細(xì)胞蛋白酶切割形成具有功能的蛋白，在類器官水平上極大提高了德?tīng)査兎N入侵細(xì)胞的效率， 也加快了德?tīng)査兎N在感染初期的復(fù)制速度，為德?tīng)査兎N優(yōu)勢(shì)建立提供了思路 (Mlcochova et al., 2021)。
免疫逃逸能力
除了感染能力的提高，關(guān)注變種也增強(qiáng)了免疫逃逸能力，以德?tīng)査兎N為例：
和野生型新冠病毒相比，新冠病毒康復(fù)者血清中和抗體對(duì)德?tīng)査兎N的中和能力平均下降6倍；
疫苗?(ChAdOx-1和BNT162b2) 對(duì)德?tīng)査兎N的防護(hù)效果平均下降8倍；
臨床批準(zhǔn)的用于治療新冠病毒相關(guān)疾病的單克隆抗體bamlavinimab 和imdevimab 對(duì)德?tīng)査兎N的中和能力分別下降1000倍和50倍 (Mlcochova et al., 2021)。
雖然關(guān)注變種對(duì)抗體介導(dǎo)的體液免疫敏感度下降，但由于關(guān)注變種在傳播過(guò)程中絕大部分人都是初次感染，體內(nèi)并沒(méi)有中和抗體，因此對(duì)已知抗體的反應(yīng)較弱能夠提示我們現(xiàn)有疫苗對(duì)于這些變種的保護(hù)性會(huì)有所下降，但不能完全解釋關(guān)注變種的大規(guī)模傳播。此外根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，德?tīng)査兎N對(duì)康復(fù)血清或疫苗后血清的中和抗體敏感性下降程度和貝塔變種(B.1.315) 接近，但傳播程度卻遠(yuǎn)超貝塔變種 (Plante et al., 2021)，這提示除了體液免疫之外，CD8+ T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答的逃逸也可能促進(jìn)了新冠病毒優(yōu)勢(shì)變種的不斷傳播。先前的研究已經(jīng)表明，細(xì)胞免疫的應(yīng)答不僅與新冠病情的輕重發(fā)展具有相關(guān)性 (Sette and Crotty, 2021)，特別地，新冠病毒特異性CD8+ T細(xì)胞早于中和抗體被檢測(cè)到，說(shuō)明細(xì)胞免疫應(yīng)答在病毒感染早期就開(kāi)始發(fā)揮作用，而這種早期的免疫抑制對(duì)于機(jī)體防御新冠病毒、抑制新冠病毒的傳播可能是非常重要的。此外，對(duì)2003年SARS康復(fù)患者的長(zhǎng)期研究表明，細(xì)胞免疫保持的時(shí)間長(zhǎng)度很長(zhǎng)，有的甚至能長(zhǎng)達(dá)17年(Le Bert et al., 2020)，而相對(duì)而言，康復(fù)患者的抗體免疫記憶則要短很多。系統(tǒng)地了解新冠病毒感染者特別是康復(fù)患者的細(xì)胞免疫應(yīng)答，對(duì)于我們了解病人的病情發(fā)展的免疫決定因素，幫助新型疫苗設(shè)計(jì)甚至預(yù)測(cè)病人對(duì)疫苗的反應(yīng)，都有重要意義。
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T-Scan技術(shù)篩選新冠病毒
特異性CD8+ T細(xì)胞抗原表位
探究細(xì)胞免疫應(yīng)答的重要步驟就是鑒定新冠病毒特異性CD8+ T細(xì)胞的抗原識(shí)別表位。清華大學(xué)譚旭課題組運(yùn)用T-Scan技術(shù)，研究了能夠引起人體CD8 T 細(xì)胞響應(yīng)的新冠病毒抗原表位的分布，并發(fā)現(xiàn)了新冠基因組上的4個(gè)氨基酸位點(diǎn)的突變可能賦予關(guān)注變種逃逸細(xì)胞免疫的能力從而促進(jìn)病毒的傳播，為關(guān)注變種的防范提供了細(xì)胞免疫方向的基礎(chǔ)? (圖1)。
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T-Scan技術(shù)是2019年由美國(guó)哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院Stephen Elledge教授發(fā)明的用于識(shí)別 T 細(xì)胞抗原的高通量篩選平臺(tái) (Kula et al., 2019)。運(yùn)用T-Scan技術(shù)構(gòu)建新冠病毒抗原呈遞的靶細(xì)胞文庫(kù)的原理如圖1所示。首先運(yùn)用DNA芯片大規(guī)模合成技術(shù)，合成覆蓋新冠病毒編碼的所有蛋白的多肽基因序列 ，每個(gè)多肽56氨基酸，一共有9179條序列。之后使用慢病毒載體將新冠病毒多肽抗原的基因文庫(kù)轉(zhuǎn)達(dá)到靶細(xì)胞中，在靶細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行多肽抗原基因的表達(dá)和多肽抗原的內(nèi)源性加工最終由靶細(xì)胞的主要組織相容性復(fù)合體 (MHC) 分子將新冠病毒抗原呈遞到細(xì)胞表面，較好地模擬了細(xì)胞被病毒感染后將病毒抗原呈遞到細(xì)胞表面的過(guò)程。此外，靶細(xì)胞還攜帶響應(yīng)顆粒酶 B（Granzyme B, GzB）活性的IFP熒光報(bào)告基因(圖3)，用于篩選被CD8+ T細(xì)胞識(shí)別的靶細(xì)胞。GzB是一種絲氨酸蛋白酶，平時(shí)儲(chǔ)存在CD8+ T細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞毒性顆粒中，當(dāng)CD8+ T細(xì)胞識(shí)別靶細(xì)胞呈遞的病毒抗原后被活化，CD8+ T開(kāi)始執(zhí)行殺傷功能，通過(guò)穿孔素在細(xì)胞膜上形成孔洞將裝載GzB的細(xì)胞毒性顆粒特異性分泌到靶細(xì)胞中。GzB進(jìn)入靶細(xì)胞后激活I(lǐng)FP熒光報(bào)告基因。接下來(lái)可以通過(guò)流式篩選富集被識(shí)別的靶細(xì)胞，并通過(guò)下一代測(cè)序鑒定靶細(xì)胞呈遞的抗原序列。
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圖3: 響應(yīng)Granzyme B (GzB) 的熒光報(bào)告系統(tǒng)
CD8+ T細(xì)胞的識(shí)別具有MHC-I類分子限制性，只能識(shí)別和自身MHC基因型匹配的MHC分子所呈遞的抗原。MHC-I類分子包括A,B,C三種基因型，稱為HLA-A、HLA-B和HLA-C，每一種基因型又包括了多種等位基因，因此MHC分子的多樣性非常豐富。作者選取了中國(guó)人群中頻率最高的四種HLA-A基因型進(jìn)行研究，包括HLA-A*02:01、HLA-A*02:07、HLA-A*11:01 和 HLA-A*24:02（分別以占中國(guó)人口的 10.9%、9.2% 、21.4%和14.4% ，http://www.allelefrequencies.net/default.asp)。
作者構(gòu)建了過(guò)表達(dá)HLA-A*02:01、HLA-A*02:07、HLA-A*11:01 或HLA-A*24:02的靶細(xì)胞文庫(kù)來(lái)呈遞新冠病毒的抗原表位。在檢測(cè)了新冠病毒康復(fù)者的HLA-A基因型之后，將基因型匹配的靶細(xì)胞文庫(kù)和新冠病毒康復(fù)者的CD8 + T細(xì)胞進(jìn)行孵育，從涵蓋了上述四個(gè)HLA基因型的10個(gè)新冠病毒康復(fù)者的PBMC中分離了記憶性CD8+ T細(xì)胞進(jìn)行T-Scan篩選，共篩選到70條潛在的新冠病毒特異性CD8+ T細(xì)胞抗原識(shí)別表位，顯著富集了新冠病毒ORF1a、ORF1b 和 S蛋白的多肽片段，說(shuō)明這三個(gè)基因可能是CD8+ T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫的重要抗原來(lái)源。
保守性CD8+ T細(xì)胞抗原表位的鑒定
圖4:?保守性CD8+ T細(xì)胞抗原表位
作者首先報(bào)道了新冠病毒和其他冠狀病毒(包括SARS，和其他4種常見(jiàn)的引起普通感冒的冠狀病毒)?在氨基酸序列上高度保守的抗原表位?(圖4)，并通過(guò)細(xì)胞內(nèi)INF-y染色的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了其中7條多肽能夠在健康人中誘導(dǎo)CD8 + T細(xì)胞的免疫應(yīng)答，這也驗(yàn)證了先前對(duì)未感染新冠人群的預(yù)存的細(xì)胞免疫記憶的研究，表明人體內(nèi)如果有針對(duì)其它冠狀病毒的細(xì)胞免疫應(yīng)答，也會(huì)針對(duì)新冠病毒有一定的交叉免疫反應(yīng)，而這種預(yù)存的細(xì)胞免疫的水平高低也可能部分決定了人群的病情差異?(Le Bert et al., 2020)。
攜帶關(guān)注變種突變的CD8+ T細(xì)胞抗原表位的鑒定
新冠病毒的S蛋白介導(dǎo)病毒進(jìn)入細(xì)胞，是中和抗體的主要識(shí)別靶點(diǎn)，S蛋白上的突變被證實(shí)能夠?qū)е虏《咎右葜泻涂贵w，也因此最為受到關(guān)注。圖5列出了4種關(guān)注變種的起源以及其在新冠病毒S蛋白上的突變位點(diǎn)。
?圖5: 新冠病毒的4種全球關(guān)注變種（關(guān)注變種）及其所攜帶的氨基酸突變位點(diǎn)
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為了探究關(guān)注變種的點(diǎn)突變是否幫助病毒逃逸CD8+ T細(xì)胞的免疫識(shí)別，作者重點(diǎn)關(guān)注了覆蓋關(guān)注變種突變位點(diǎn)的4條抗原表位 : GVY、KIA、NYN、IIW；這四條抗原表位分別包括了S蛋白上的Y144-缺失突變、K417N/T突變、L452R突變和ORF1a蛋白上的I2230T突變。通過(guò)胞內(nèi)IFN-γ檢測(cè)和MHC-四聚體染色的方法，作者驗(yàn)證了這四條抗原表位能夠有效引起新冠康復(fù)患者或疫苗免疫后志愿者的CD8+ T細(xì)胞免疫應(yīng)答。為了進(jìn)一步探究關(guān)注變種攜帶的突變對(duì)CD8+ T細(xì)胞免疫的影響，作者合成了攜帶突變位點(diǎn)的抗原多肽，并比較了野生型抗原多肽和突變多肽的抗原有效性。對(duì)比發(fā)現(xiàn)，和野生型多肽相比，新冠康復(fù)患者/疫苗免疫后志愿者的CD8+ T細(xì)胞對(duì)攜帶突變位點(diǎn)的抗原多肽的響應(yīng)能力下降（圖6）。這說(shuō)明了這些位點(diǎn)的氨基酸對(duì)抗原識(shí)別及細(xì)胞免疫的產(chǎn)生非常重要，而關(guān)注變種將這些關(guān)鍵氨基酸突變之后，可能會(huì)降低病毒對(duì)細(xì)胞免疫的刺激，從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞免疫的逃逸。
為了探究關(guān)注變種的點(diǎn)突變是否幫助病毒逃逸CD8+ T細(xì)胞的免疫識(shí)別，作者重點(diǎn)關(guān)注了覆蓋關(guān)注變種突變位點(diǎn)的4條抗原表位 : GVY、KIA、NYN、IIW；這四條抗原表位分別包括了S蛋白上的Y144-缺失突變、K417N/T突變、L452R突變和ORF1a蛋白上的I2230T突變。通過(guò)胞內(nèi)IFN-γ檢測(cè)和MHC-四聚體染色的方法，作者驗(yàn)證了這四條抗原表位能夠有效引起新冠康復(fù)患者或疫苗免疫后志愿者的CD8+ T細(xì)胞免疫應(yīng)答。為了進(jìn)一步探究關(guān)注變種攜帶的突變對(duì)CD8+ T細(xì)胞免疫的影響，作者合成了攜帶突變位點(diǎn)的抗原多肽，并比較了野生型抗原多肽和突變多肽的抗原有效性。對(duì)比發(fā)現(xiàn)，和野生型多肽相比，新冠康復(fù)患者/疫苗免疫后志愿者的CD8+ T細(xì)胞對(duì)攜帶突變位點(diǎn)的抗原多肽的響應(yīng)能力下降（圖6）。這說(shuō)明了這些位點(diǎn)的氨基酸對(duì)抗原識(shí)別及細(xì)胞免疫的產(chǎn)生非常重要，而關(guān)注變種將這些關(guān)鍵氨基酸突變之后，可能會(huì)降低病毒對(duì)細(xì)胞免疫的刺激，從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞免疫的逃逸。
圖6：?抗原表位的突變降低了對(duì)疫苗接種者及新冠康復(fù)者體內(nèi)CD8+ T 細(xì)胞激活的效率
關(guān)注變種突變破壞HLA分子呈遞CD8+ T細(xì)胞抗原表位的結(jié)構(gòu)機(jī)制
更近一步，金騰川教授課題組通過(guò)晶體學(xué)的方法，解析了其中2條抗原表位和對(duì)應(yīng)MHC分子的復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)?(圖7)?？梢郧逦乜吹皆贙IA-HLA-A*02:01復(fù)合物（圖7A）中，417位的賴氨酸的正電荷側(cè)鏈與HLA-A*02:01蛋白的W167通過(guò)Pi陽(yáng)離子相互作用牢牢結(jié)合，貝塔變種和伽馬變種攜帶的K417N/T突變將打破這一相互作用，導(dǎo)致HLA-A*02:01蛋白無(wú)法識(shí)別這一抗原表位，作者也通過(guò)生化的方法證明了這一結(jié)論。在NYN-HLA-A*24:02復(fù)合物（圖7B）中，452位的亮氨酸的疏水側(cè)鏈埋在了HLA-A*24:02蛋白表面的疏水口袋中，通過(guò)疏水相互作用緊密結(jié)合，關(guān)鍵位點(diǎn)452位氨基酸的突變可能幫助病毒逃逸抗原表位NYN介導(dǎo)的細(xì)胞免疫。
? ? ? ? ? A ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?B
圖7:? KIA&HLA-A*02:01復(fù)合物 (A) 和NYN&HLA-A*24:02復(fù)合物 (B) 的晶體結(jié)構(gòu)
?以德?tīng)査兎N為例，德?tīng)査兎N攜帶的L452R的突變將引入帶正電荷的精氨酸R，完全破壞了原有的疏水相互作用，進(jìn)而破壞NYN抗原表位的呈遞。2021年7月Motozono 等人在Cell Host & Microbe雜志上報(bào)道了L452R介導(dǎo)新冠病毒的細(xì)胞免疫逃逸 (Motozono et al., 2021)，這篇研究也為此進(jìn)一步提供了結(jié)構(gòu)學(xué)基礎(chǔ)。
總結(jié)
新冠病毒關(guān)注變種對(duì)免疫系統(tǒng)的逃逸大大增加了全球疫苗接種計(jì)劃的復(fù)雜度，了解關(guān)注變種免疫逃逸機(jī)制對(duì)未來(lái)疫苗的設(shè)計(jì)具有重要意義。先前的研究證實(shí)了HIV的進(jìn)化動(dòng)力之一就是通過(guò)突變CD8+ T細(xì)胞識(shí)別的抗原表位來(lái)達(dá)到逃逸細(xì)胞免疫的目的 (Allen et al., 2005; Kawashima et al., 2009; Moore et al., 2002)。這篇文章中，作者通過(guò)T-Scan技術(shù)篩選并鑒定了4條新冠病毒特異性CD8+ T細(xì)胞識(shí)別的關(guān)鍵性抗原表位，而新冠病毒關(guān)注變種（阿爾法, 貝塔, 伽馬 和德?tīng)査┲辽偻蛔兞似渲幸粭l關(guān)鍵性抗原表位，揭示了逃逸人體細(xì)胞免疫是新冠流行變種的普遍特點(diǎn)。除此之外，作者篩選到的冠狀病毒保守性抗原表位，也為后續(xù)的冠狀病毒的通用疫苗設(shè)計(jì)提供了理論基礎(chǔ)。
清華大學(xué)藥學(xué)院博士生張航和中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)生命科學(xué)與醫(yī)學(xué)部博士生鄧莎莎為本文共同一作，譚旭教授和金騰川教授為本文共同通訊作者。該研究受到了國(guó)家自然科學(xué)基金委，清華大學(xué)春風(fēng)基金以及中科院先導(dǎo)項(xiàng)目的資助。清華大學(xué)董晨實(shí)驗(yàn)室，林欣實(shí)驗(yàn)室和石彥實(shí)驗(yàn)室為本項(xiàng)目提供了大力幫助。
原文鏈接：https://www.cell.com/cell-reports/fulltext/S2211-1247(21)01155-4
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