陳飛團隊《Molecular Cell》揭示真核生物轉錄機器在轉錄早期命運決定的機制
?基因表達的精準調控，對機體發(fā)育和細胞的各種生理功能的維持至關重要。基因表達的紊亂，則影響著眾多的生理和病理過程。轉錄是基因表達調控最關鍵的步驟，因此轉錄調控機制的研究一直是分子生物學的核心課題。真核生物大多數(shù)基因的轉錄主要分為轉錄起始（initiation）、暫停（pausing）、延伸（elongation）和終止（termination）四個步驟，每個步驟都涉及到RNA聚合酶II（Pol II）與對應的轉錄起始因子、延伸因子或終止因子之間的相互作用和調控。
?轉錄延伸因子SPT5（細菌的同源蛋白為NusG/RfaH）是唯一在所有生物中都保守的轉錄調節(jié)因子。NusG/RfaH在細菌的轉錄和翻譯的偶連中起到了重要作用（詳見BioArt報道：3篇Science | 轉錄和翻譯的一次“牽手”——“紅娘” NusG 背后的故事），在真核生物中SPT5會與SPT4形成DSIF復合物來調控Pol II轉錄的延伸（transcription elongation）。有趣的是，SPT5在多細胞生物中又演化出調控啟動子近端Pol II暫停（promoter-proximal Pol II pausing）的功能。
?Pol II在轉錄起始后延伸到20-100 bp后暫停的現(xiàn)象被稱為啟動子近端Pol II暫停，這是轉錄調控的核心；該區(qū)域的穩(wěn)定主要依賴于negative elongation factor (NELF)，DRB sensitivity-inducing factor (DSIF)和Pol II-associated factor 1 (PAF1)等復合物來維持。暫停的Pol II在暫停之后，會在“有效的轉錄延伸（productive release）”和“早期終止 (early termination)”兩種命運之間進行選擇。當激酶復合物p-TEFb被招募到pausing位點后，它能磷酸化Pol II CTD、DSIF和NELF，使得NELF解離；隨后暫停的Pol II被轉錄延伸因子DSIF等激活，從而進入高效的轉錄延伸階段（productive elongation）。
?激酶p-TEFb可介導SPT5的第666位點絲氨酸S666和CTR1-T806的磷酸化，而Integrator-PP2A (INTAC)可能做為SPT5的磷酸酶。激酶和磷酸酶如何拮抗SPT5的磷酸化狀態(tài)以及是如何精確調控核心的轉錄機器還有待研究。
?2021年9月16日，我院陳飛課題組在Molecular Cell雜志上在線發(fā)表題為SPT5 stabilizes RNA polymerase II, orchestrates transcription cycles, and maintains the enhancer landscape的研究論文。該項研究利用誘導型蛋白降解系統(tǒng)dTAG并結合轉錄調控高通量研究方法，發(fā)現(xiàn)轉錄調控因子SPT5能夠直接促進轉錄機器的蛋白質穩(wěn)定性；在轉錄層面，SPT5能夠調控增強子（enhancer）活性，穩(wěn)定暫停的Pol II，并促進暫停Pol II的釋放、轉錄延伸和轉錄終止。其中，SPT5第666位的絲氨酸（S666）的磷酸化特異性促進暫停Pol II的釋放，而CTR1的磷酸化特異性調控轉錄終止。同時，這兩個位點均能被磷酸酶INTAC去磷酸化，說明了SPT5介導的INTAC的功能。
?ROTACs由靶蛋白配體、E3泛素連接酶配體和連接鏈三部分組成，該分子能分別識別靶蛋白和E3泛素連接酶來誘導靶蛋白的多聚泛素化，從而使靶蛋白能夠被蛋白酶體識別并降解。dTAG是一種能將CRBN泛素連接酶和FKBP12F36V連接起來的新化合物，該系統(tǒng)只要將FKBP12F36V與目標蛋白融合就能實現(xiàn)對其快速且特異的降解。
?為了研究SPT5蛋白對基因轉錄直接的調控作用，該研究利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)構建了FKBP12F36V-SPT5（SPT5-dTAG）細胞系，從而可以對內源SPT5蛋白進行動態(tài)調控。比較意外的是，隨著SPT5蛋白的降解，RNA 聚合酶II最大的亞基RPB1蛋白也隨之減少，并且RPB1 pSer5（與啟動子暫停pausing相關）減少的量比RPB1 pSer2（與轉錄延伸相關）的大；用ChIP-Rx也驗證了這一結果，說明細胞水平和染色質水平上的RPB1均減少。進一步研究發(fā)現(xiàn)RPB1蛋白的減少是通過泛素化降解途徑進行的。
?PRO-seq?(Precision nuclear run-on sequencing)技術是以單個堿基的分辨率檢測轉錄Pol II的定位和轉錄活性的高精度轉錄調控研究方法。利用PRO-seq技術分析SPT5蛋白快速降解的細胞系發(fā)現(xiàn)：1）基因啟動子暫停的Pol II急劇減少，基本沒看到pause release的想象；2）轉錄的持續(xù)性（processivity）顯著降低；3）在基因轉錄終止的區(qū)域有明顯的轉錄 “順讀”（transcription readthrough）。這些結果說明SPT5在維持暫停Pol II蛋白的穩(wěn)定性、轉錄延伸和轉錄終止等方面有重要的調控作用。
?增強子（enhancer）能通過在時空上精確的調控靶基因的表達。它的轉錄也依賴于Pol II，基于上述SPT5蛋白對mRNA基因轉錄的調控作用，促使研究人員去探究其對增強子轉錄活性的影響。通過ATAC-seq 分析發(fā)現(xiàn) SPT5蛋白的缺失造成了約25%的增強子染色質的可及性（chromatin accessibility）顯著下降。通過H3K27ac，MED1和BRG1（染色質重塑復合物BAF的催化亞基）的ChIP-Rx分析，它們在增強子上的信號也減弱。以上結果說明SPT5也能調控增強子的轉錄活性。
?SPT5做為最保守的轉錄調節(jié)因子，激酶p-TEFb能催化SPT5 S666和CTR1位點的磷酸化。為了回答這兩個修飾的對轉錄的調控作用，研究人員分別用這兩個突變位點的SPT5蛋白（SPT5 S666A，SPT5 CTR1-T4A）做了回補實驗。發(fā)現(xiàn)SPT5 S666A會使啟動子區(qū)暫停Pol II（pausing）信號增強而基因內部Pol II信號減弱，提示SPT5 S666的磷酸化可能跟Pol II的釋放（release）有關；SPT5 CTR1-T4A則讓基因轉錄終止信號提前，說明SPT5 CTR1磷酸化與轉錄終止相關。有意思的是，這兩個位點的磷酸化均能被磷酸酶INTAC去除，提示INTAC在轉錄暫停和轉錄終止這兩個階段發(fā)揮著重要的作用。
?綜上所述，SPT5蛋白分別從影響增強子的轉錄活性、Pol II蛋白的穩(wěn)定性、轉錄暫停（pausing）、延伸（elongation）和終止（termination）等方面來調控轉錄核心機器的運轉，為將來研究其生理病理的功能提供理論指導。
?據(jù)悉，復旦大學附屬腫瘤醫(yī)院助理研究員胡士斌、博士后彭林娜和徐從玲為本文共同第一作者，博士生王振寧和宋愛霞對本文也有重要的貢獻，陳飛為本文的通訊作者。TT-seq實驗得到武漢大學梁凱威教授和王紅紅同學的幫助。
?值得一提的是，近日美國西北大學Ali?Shilatifard課題組在Molecular Cell雜志上在線發(fā)表題為SPT5 stabilization of promoter-proximal RNA polymerase II的研究論文。該研究解析了SPT5蛋白缺失后RPB1蛋白的降解機制，發(fā)現(xiàn)E3泛素連接酶CUL3和解折疊酶VCP是必需的。該研究與陳飛團隊第一部分的發(fā)現(xiàn)一致。
原文鏈接：https://doi.org/10.1016/j.molcel.2021.08.029
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