賀福初/丁琛團(tuán)隊(duì)《Science Advances》報(bào)道精密解析染色質(zhì)開放區(qū)域蛋白質(zhì)-DNA轉(zhuǎn)錄機(jī)器的“工具包”
?轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白質(zhì)機(jī)器由轉(zhuǎn)錄因子（transcirption factor，TF）、轉(zhuǎn)錄輔助因子（transcirptional coregulator，?TC）等構(gòu)成，其在幾乎所有生物學(xué)進(jìn)程（如分化、發(fā)育、細(xì)胞周期控制和細(xì)胞凋亡等）中都發(fā)揮著關(guān)鍵作用。基因的轉(zhuǎn)錄過程依賴于轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白質(zhì)機(jī)器與DNA結(jié)合并行使相應(yīng)功能，二者的結(jié)合是基因啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的前提。真核生物基因組中的染色質(zhì)有一些區(qū)域經(jīng)染色質(zhì)重塑后呈現(xiàn)出松散的狀態(tài)，這部分?DNA?區(qū)域被稱為開放染色質(zhì)（open chromatin）或可接近性染色質(zhì)（accessible chromatin），而染色質(zhì)是否呈疏松結(jié)構(gòu)，是蛋白質(zhì)機(jī)器與DNA是否互作的關(guān)鍵因素之一。
?在基因組層面，2013年，斯坦福大學(xué)的Howard Chang教授開發(fā)了ATAC-seq技術(shù)（Assay for Transposase-Accessible Chromatin with highthroughput sequencing），可以通過高通量測序獲得染色質(zhì)開放區(qū)和基因組中活躍轉(zhuǎn)錄的調(diào)控序列的關(guān)鍵信息。而在蛋白質(zhì)組水平，由于轉(zhuǎn)錄因子和轉(zhuǎn)錄共調(diào)節(jié)因子表達(dá)豐度低且缺乏相關(guān)富集技術(shù)，科學(xué)界仍然難以對上述蛋白分子與染色質(zhì)開放區(qū)的結(jié)合配對關(guān)系進(jìn)行全景式的精細(xì)解析。
?2021年10月22日，我院賀福初/丁琛團(tuán)隊(duì)在Science Advances在線發(fā)表了題為Proteome-wide profiling of transcriptional machinery on accessible chromatin with biotinylated transposons的有關(guān)蛋白質(zhì)-DNA轉(zhuǎn)錄機(jī)器的最新研究成果。該成果顯示，復(fù)旦大學(xué)團(tuán)隊(duì)在世界范圍內(nèi)首次實(shí)現(xiàn)了染色質(zhì)開放區(qū)轉(zhuǎn)錄蛋白機(jī)器的鑒定及功能研究。
?多年來，賀福初/丁琛團(tuán)隊(duì)，聚焦這一難題持續(xù)開展科研攻關(guān)。早在2013年，丁琛/秦鈞團(tuán)隊(duì)開發(fā)catTFRE技術(shù)，首次設(shè)計(jì)合成了串聯(lián)各種轉(zhuǎn)錄因子的多拷貝雙鏈DNA結(jié)合元件，從核蛋白中富集具有DNA結(jié)合活性的內(nèi)源轉(zhuǎn)錄因子及其復(fù)合物，對開展轉(zhuǎn)錄調(diào)控具有重大價(jià)值。
?在本次發(fā)表的最新成果中，科研人員基于ATAC-seq技術(shù)，開發(fā)出直接富集和定量內(nèi)源性染色質(zhì)開放區(qū)域?qū)崟r(shí)原位轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄蛋白機(jī)器的新方法ATAC-MS（圖1）。該技術(shù)利用生物素化的高活性Tn5轉(zhuǎn)座子，特異性結(jié)合染色質(zhì)開放區(qū)暴露的DNA，將DNA片段化并進(jìn)行生物素（biotin）標(biāo)記。而后通過鏈霉親和素偶聯(lián)的磁珠與生物素化的DNA反應(yīng)，分離純化出DNA及DNA上結(jié)合的轉(zhuǎn)錄復(fù)合物。對上述復(fù)合物分別進(jìn)行蛋白質(zhì)酶解-肽段純化與DNA純化-文庫構(gòu)建，可用于平行的質(zhì)譜鑒定與二代測序分析，由此可直接觀測獲得轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白質(zhì)機(jī)器信息及其結(jié)合序列motif信息。
圖1. ATAC-MS原理示意圖
?該方法在使用低至5×105的細(xì)胞量時(shí)，便可對轉(zhuǎn)錄因子和轉(zhuǎn)錄共調(diào)控因子的鑒定有著較好的靈敏性和特異性（圖2）。與ATAC-seq檢測到轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合序列不同，ATAC-MS可以直接捕獲轉(zhuǎn)錄因子(TF)及與之共同作用的轉(zhuǎn)錄復(fù)合物。
圖2. ATAC-MS對TF、TC的檢測靈敏度檢測
?使用腫瘤壞死因子（TNF-α）對HeLa細(xì)胞進(jìn)行刺激后，ATAC-MS成功鑒定到轉(zhuǎn)錄因子NFKB家族及與其相互作用的TFs的變化（圖3）。此外，使用雌激素受體17β雌二醇（E2)及其拮抗物4-羥基他莫昔芬（4-Hydroxytamoxifen）刺激MCF7細(xì)胞時(shí)，ATAC-MS不僅能檢測到核心轉(zhuǎn)錄因子ESR1的變化，還能觀測到E2的刺激導(dǎo)致與ESR1共同作用轉(zhuǎn)錄共激活因子（coactivator），如NCOA3，EP300等的富集。而在4-HT的刺激下，轉(zhuǎn)錄共抑制因子（corepressor）如NCOR1, HDAC2等也可被ATAC-MS成功捕獲。這證實(shí)了對于轉(zhuǎn)錄共調(diào)節(jié)因子的高富集能力是ATAC-MS技術(shù)的優(yōu)勢。
圖3. ATAC-MS檢測TNF-α刺激應(yīng)答轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物?
?進(jìn)一步的，該團(tuán)隊(duì)將ATAC-MS技術(shù)與陰離子交換技術(shù)結(jié)合，開發(fā)出高分辨率ATAC-MS解析技術(shù)（fractionation ATAC-MS，fATAC-MS）。利用不同濃度鹽溶液洗脫，將DNA-轉(zhuǎn)錄機(jī)器復(fù)合物分成不同組分，降低復(fù)雜度，提供更高分辨率的轉(zhuǎn)錄蛋白-DNA圖譜。實(shí)驗(yàn)顯示，不同組分中的共洗脫蛋白質(zhì)/DNA成分顯示出特征性的功能和特征性的DNA結(jié)合基序。一些具有保守功能的蛋白質(zhì)復(fù)合物，如RNA聚合酶II相關(guān)蛋白和染色質(zhì)修飾酶（HDACs等）在所有組分中被廣泛洗脫和鑒定。這些發(fā)現(xiàn)顯示了fATAC-MS在全基因組范圍內(nèi)進(jìn)行高分辨率蛋白質(zhì)機(jī)器-DNA互作關(guān)系解析的應(yīng)用潛能。這展示了ATAC-MS可用于在全基因組水平繪制蛋白質(zhì)-DNA轉(zhuǎn)錄調(diào)控復(fù)合物圖譜。
?進(jìn)一步的，作者設(shè)計(jì)并表達(dá)了一種新型Tn5-dCas9融合蛋白，將ATAC-MS升級(jí)為具有靶向性的ctATAC-MS(dCas9 targeted ATAC-MS)。在沒有sgRNA的情況下，Tn5-dCas9融合蛋白作為Tn5轉(zhuǎn)座子與開放染色質(zhì)結(jié)合,由此可用于全基因組水平的轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白質(zhì)機(jī)器；而在有sgRNA的指導(dǎo)下，Tn5-dCas9對特定靶向的DNA序列具有親和力，可精確揭示特定位點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白質(zhì)復(fù)合物。升級(jí)的ctATAC-MS方法系統(tǒng)地描述了在小鼠肝臟晝夜節(jié)律時(shí)鐘中靶向E-box的轉(zhuǎn)錄過程，揭示了不同轉(zhuǎn)錄因子在晝夜節(jié)律中的潛在機(jī)制。
?綜上，賀福初/丁琛團(tuán)隊(duì)本次發(fā)表的研究提供了一個(gè)包括3種全新方法——ATAC-MS、fATAC-MS和ctATAC-MS在內(nèi)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控復(fù)合物解析“工具包”，使得我們既能夠在全基因組層面繪制活躍的轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白質(zhì)機(jī)器圖譜，也可以在特定基因組位點(diǎn)上探究蛋白質(zhì)-DNA轉(zhuǎn)錄調(diào)控復(fù)合物。該工具包將使該領(lǐng)域的研究人員能夠深入挖掘不同層次的轉(zhuǎn)調(diào)控機(jī)制，并具有兼顧體內(nèi)/體外反應(yīng)的特點(diǎn)，在臨床活檢、多種組織標(biāo)本檢測和不同物種檢驗(yàn)等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用潛能。
?該研究得到上海市市級(jí)科技重大專項(xiàng)“國際人類表型組計(jì)劃（一期）”的支持。復(fù)旦大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院2017級(jí)博士生張海珠、復(fù)旦大學(xué)人類表型組研究院副研究員秦兆宇、復(fù)旦大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院2018級(jí)博士生岳雪彤為本文共同第一作者。上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院楊雯雋研究員，中國科學(xué)院院士、遺傳工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室和復(fù)旦大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院特聘PI及人類表型組研究院特聘導(dǎo)師賀福初教授，復(fù)旦大學(xué)人類表型組研究院副院長、遺傳工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、生命科學(xué)學(xué)院及生物醫(yī)學(xué)研究院丁琛研究員為該論文的共同通訊作者。
論文鏈接：https://doi.org/10.1126/sciadv.abh1022
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