我校創(chuàng)建綠色生物制造底盤細胞的高效編輯工具
（通訊員：劉濤）核心提示：近期，我校彭楠教授課題組聯(lián)合農(nóng)業(yè)農(nóng)村部沼氣科學研究所何明雄研究院團隊，建立了綠色生物制造重要底盤微生物運動發(fā)酵單胞菌和乳酸片球菌的高效基因組編輯工具。
近期，我校農(nóng)業(yè)微生物學國家重點實驗室暨湖北省洪山實驗室彭楠教授課題組聯(lián)合農(nóng)業(yè)農(nóng)村部沼氣科學研究所何明雄研究院團隊，揭示了細菌新型DNA損傷修復系統(tǒng)的工作規(guī)律，并結(jié)合細菌內(nèi)源性CRISPR-Cas系統(tǒng)，建立了綠色生物制造重要底盤微生物運動發(fā)酵單胞菌和乳酸片球菌的高效基因組編輯工具。上述成果分別發(fā)表在Journal of Genetics and Genomics（封面文章）， Applied and Environmental Microbiology和Biotechnology for Biofuels等期刊上。
運動發(fā)酵單胞菌（Zymomonas mobilis）是一種能夠在厭氧條件下直接利用ED途徑代謝糖類產(chǎn)生乙醇的細菌，具有乙醇發(fā)酵速率高、乙醇耐受性好及生物安全等特點,在生物燃料應(yīng)用方面具有巨大的應(yīng)用價值。課題組研究發(fā)現(xiàn)CRISPR-Cas系統(tǒng)造成的基因組DNA損傷會高效地被微同源介導的連接途徑（MMEJ）修復，并造成部分DNA缺失。而MMEJ系統(tǒng)修復CRISPR-Cas造成的移動元件損傷的效率很低，代表了一種切割后區(qū)別自己和異己DNA的識別模式。該成果作為封面文章發(fā)表在Journal of Genetics and Genomics雜志上，我校王曉婕博士生為論文共同第一作者。
圖1.運動發(fā)酵單胞菌利用MMEJ途徑區(qū)別修復CRISPR-Cas系統(tǒng)造成的基因組DNA和可移動元件的損傷
在此基礎(chǔ)上，課題組利用內(nèi)源性CRISPR-Cas系統(tǒng)和MMEJ途徑開發(fā)了一種適用于運動發(fā)酵單胞菌進行快速基因組編輯和必需基因鑒定的工具。該工具只需要構(gòu)建一個帶有mini-CRISPR（Repeat-Spacer-Repeat）的自靶向質(zhì)粒即可實現(xiàn)靶基因和長片段的敲除。此外，通過改造mini-CRISPR的第二個重復序列（Repeat）進一步提高了該工具的編輯效率。該成果發(fā)表在Biotechnology for Biofuels雜志上，我校隋欣博士生為論文第一作者。
圖2.基于內(nèi)源性CRISPR-Cas系統(tǒng)和MMEJ途徑的基因組快速編輯流程
乳酸片球菌是飼料、醫(yī)藥目錄內(nèi)的重要益生菌，廣泛地應(yīng)用于乳酸和飼料發(fā)酵以及免疫調(diào)節(jié)等生產(chǎn)實踐和臨床治療中。課題組前期分離到一株生產(chǎn)性能好、益生性能強的乳酸片球菌，發(fā)現(xiàn)其基因組編碼CRISPR-Cas9系統(tǒng)。盡管該cas9基因發(fā)生無義突變，課題組研究表明其仍能行使核酸切割功能。基于該內(nèi)源性CRISPR-Cas9系統(tǒng)，課題組建立了高效的遺傳操作工具，實現(xiàn)了高效的基因敲除、點突變和整合。利用該技術(shù)消除內(nèi)源性質(zhì)粒和整合超表達乳酸脫氫酶基因顯著提升了乳酸片球菌的生長速率及乳酸生產(chǎn)速率。該成果發(fā)表在Applied and Environmental Microbiology雜志上，我校劉玲博士生為論文第一作者，課題組獲授權(quán)發(fā)明專利一項。該工作為益生菌合成生物學研究打下了堅實的基礎(chǔ)。
圖3.整合超表達乳酸脫氫酶基因顯著提高乳酸片球菌的生長速率和乳酸生產(chǎn)速率
論文鏈接：
1. Wang, X., Wu, B., Sui, X., Zhang, Z., Liu, T., Li, Y., Hu, G., He, M., Peng, N. 2021. CRISPR-mediated host genomic DNA damage is efficiently repaired through microhomology-mediated end joining in Zymomonas mobilis. J Genet Genomics, 48(2), 115-122. https://doi.org/https://doi.org/10.1016/j.jgg.2021.02.012
2. Sui, X., Wang, X., Liu, T., Ye, Q., Wu, B., Hu, G., Yang, S., He, M., Peng, N. 2021. Endogenous CRISPR-assisted microhomology-mediated end joining enables rapid genome editing in Zymomonas mobilis. Biotechnol Biofuels, 14(1), 208. https://doi.org/10.1186/s13068-021-02056-z
3. Liu, L., Yang, D., Zhang, Z., Liu, T., Hu, G., He, M., Zhao, S., Peng, N. 2021. High-efficiency genome editing based on endogenous CRISPR-Cas system enhances cell growth and lactic acid production in Pediococcus acidilactici. Appl Environ Microbiol, 87(20), e0094821. https://doi.org/10.1128/AEM.00948-21
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