最新研究成果 | 多肽測(cè)序應(yīng)用新發(fā)現(xiàn) | 清華大學(xué)藥學(xué)院白凈衛(wèi)課題組 Chem Sci：巧妙控制多肽通過納米孔道，實(shí)現(xiàn)多肽測(cè)序應(yīng)用重要一步
時(shí)間：2021-11-20 15:22:52學(xué)院：藥學(xué)院學(xué)校：清華大學(xué)
研究背景
- 作為細(xì)胞的重要組成成分，蛋白質(zhì)是由不同氨基酸按照一定的順序排列形成的，氨基酸順序不同會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)不同，結(jié)構(gòu)決定功能，從而形成成千上萬種具有不同功能的蛋白質(zhì)，滿足正常的生命活動(dòng)。
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- 其次，某種蛋白質(zhì)氨基酸序列改變——即使是單個(gè)氨基酸的突變或者修飾——會(huì)使蛋白質(zhì)的功能發(fā)生改變，進(jìn)而影響正常的生命活動(dòng)，像大多數(shù)癌癥都是由于基因突變導(dǎo)致蛋白質(zhì)氨基酸改變而引起的。
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- 最后，某些蛋白質(zhì)也可以作為藥物和生物標(biāo)志物，作為疾病早期檢測(cè)的指標(biāo)。
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綜上可知蛋白質(zhì)序列的研究對(duì)于預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，疾病的檢測(cè)和蛋白質(zhì)類藥物的開發(fā)具有重要意義。
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目前能夠用于的蛋白質(zhì)測(cè)序方法有質(zhì)譜測(cè)序和 Edman 降解法。質(zhì)譜法和 Edman 降解法操作過程復(fù)雜、樣品需求量大、純度要求高、耗時(shí)較長(zhǎng)、通量低，且 Edman 降解法不能檢測(cè) N 端氨基被封閉的樣品，且僅僅只能檢測(cè) 50 個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的多肽。
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然而，蛋白質(zhì)在生物體中都是以混合物的形式存在，而生物體內(nèi)也存在稀有的蛋白質(zhì)突變；另一方面，前蛋白質(zhì)還沒有像 DNA 和 RNA 那樣可以通過 PCR 方法實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增的技術(shù)。鑒于此，對(duì)于這些稀有蛋白質(zhì)因濃度過低和純度較差而不能用目前的蛋白質(zhì)測(cè)序技術(shù)進(jìn)行測(cè)序，急需一種高通量、低成本、樣品需求少、操作簡(jiǎn)單的蛋白質(zhì)測(cè)序技術(shù)。
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論文概述
?本文巧妙利用解旋酶控制 DNA 的運(yùn)動(dòng)，進(jìn)而控制其所鏈接的多肽按照氨基酸線性順序通過一個(gè)納米孔道，進(jìn)而得以通過電信號(hào)的變化檢出其氨基酸序列。
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這種檢測(cè)技術(shù)實(shí)現(xiàn)了 17 個(gè)氨基酸長(zhǎng)度多肽檢測(cè)，在中性多肽骨架中，雖然沒有實(shí)現(xiàn)單氨基酸的精確分辨，但是可以非常明顯的區(qū)分帶負(fù)電的氨基酸，例如天門冬氨酸，谷氨酸和磷酸化的絲氨酸。同時(shí)也發(fā)現(xiàn)了多肽測(cè)序中不同電荷對(duì)多肽運(yùn)動(dòng)的影響。此外，本文發(fā)現(xiàn)解旋酶 (helicase) 的雙聚體可以實(shí)現(xiàn)對(duì)同一多肽的反復(fù)測(cè)序，這為進(jìn)一步提高多肽測(cè)序的準(zhǔn)確率奠定了基礎(chǔ)。
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圖1. 文章作者巧妙利用解旋酶控制 DNA 的運(yùn)動(dòng)進(jìn)而控制其所鏈接的多肽按照氨基酸線性順序通過 MspA 納米孔。該方法的重點(diǎn)在于使用一個(gè)適合回溯測(cè)序的 DNA 動(dòng)力蛋白，例如本文所使用的 MTA 解旋酶，以及一個(gè)檢測(cè)區(qū) (constriction) 在蛋白通道底部的納米孔蛋白，例如 MspA-M2 納米孔。
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由于 MspA 的檢測(cè)區(qū)到頂端的距離較長(zhǎng)，因此為了檢測(cè)更長(zhǎng)的多肽，該文作者們選擇 MspA-M2 作為檢測(cè)時(shí)所用的納米孔。他們合成了不同長(zhǎng)度的多肽，在多肽一端加上 ssDNA，另一端添加上 ployT；當(dāng) polyT 的信號(hào)被檢測(cè)到時(shí)即證明多肽已被檢測(cè)完全。
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經(jīng)過數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)達(dá)到 17aa 時(shí) polyT 信號(hào)的出現(xiàn)概率還在 50% 以上，但對(duì)于 18aa 和 19aa 而言 polyT 信號(hào)已幾乎檢測(cè)不到。如此可以認(rèn)為該方法可檢測(cè)的多肽長(zhǎng)度為 17aa。
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為了進(jìn)一步增加測(cè)序的長(zhǎng)度，作者們將 MTA 解旋酶 (MTA-h) 融合表達(dá)。雖然結(jié)果顯示檢測(cè)的長(zhǎng)度并未增加，但可以發(fā)現(xiàn)對(duì)于同一多肽鏈可以多次讀取?？赡艿脑蚴牵陔p酶系統(tǒng)中，當(dāng)多肽到達(dá)下方的 MTA-h 時(shí)，下方的 MTA-h 遠(yuǎn)離 MspA-M2 頂端，使得上方的 MTA-h 瞬間下降，而由于上方的 MTA-h 仍然結(jié)合在 ssDNA 上，因此可以再次使多肽鏈勻速地通過 MspA-M2 的檢測(cè)區(qū)，從而實(shí)現(xiàn)了多次檢測(cè)。該種測(cè)序方法對(duì)于提高測(cè)序的準(zhǔn)確度具有十分重要的意義。
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作者們?cè)谠摱嚯逆湹?5 和 9 號(hào)位分別進(jìn)行了單突變構(gòu)建及磷酸化修飾，同時(shí)在 5、6 位點(diǎn)進(jìn)行了雙突變；當(dāng) 5 號(hào)為突變成酸性氨基酸，或被磷酸化修飾后，電流波形圖上均會(huì)產(chǎn)生一個(gè)小駝峰（相較于氨基酸突變及非磷酸化的情況）；當(dāng) 9 號(hào)為突變成酸性氨基酸并發(fā)生磷酸化修飾后，也會(huì)產(chǎn)生較 5 號(hào)位后移的一個(gè)小駝峰；當(dāng) 5、6 號(hào)位雙突變成酸性氨基酸時(shí)，小駝峰的信號(hào)會(huì)進(jìn)一步增強(qiáng)。
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幾乎所有的中性或者帶有酸性氨基酸殘基的多肽信號(hào)中都普遍出現(xiàn)了位于“DNA-多肽”信號(hào)轉(zhuǎn)換區(qū)的大量毛刺型電流振蕩，而堿性氨基酸 K 或 R 的突變卻未發(fā)生明顯的代表電流振蕩的毛刺現(xiàn)象。其中的原因可能是 DNA-多肽轉(zhuǎn)換區(qū)中存在著一個(gè)從強(qiáng)負(fù)電荷到中性或者弱電荷的轉(zhuǎn)換。在這一過程中，原先的 DNA 在電場(chǎng)中受到的拉伸作用有可能被迅速地釋放，從而形成類似于彈簧松弛的振蕩。另一方面，K 或 R 的正電荷在電場(chǎng)中產(chǎn)生了一個(gè)對(duì)于多肽向上的推力，使得這一轉(zhuǎn)化過程縮短或者抑制了振蕩。
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小結(jié)
?與最近發(fā)表在 Nano Letter 和 Science 上的兩篇論文類似，本文也展示了通過 DNA 馬達(dá)控制“DNA-解旋酶”穿過 MspA 納米孔的工作，進(jìn)而獲得與序列相關(guān)的電流信號(hào)。不同的是，本文選擇了非帶電的多肽骨架，因此發(fā)現(xiàn)了與前文截然不同的信號(hào)模式。
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當(dāng)不帶電或所帶電荷較少的多肽鏈通過納米孔時(shí)，其過孔電流信號(hào)并不像 DNA 和 RNA 那樣具有明顯的電流臺(tái)階信息（其原因有可能是這類多肽骨架在 MspA-M2 的檢測(cè)區(qū)并不以被拉伸的狀態(tài)存在），所產(chǎn)生的電流可能是多個(gè)氨基酸的貢獻(xiàn)；這類多肽骨架上的負(fù)電荷突變（比如 D、E 以及磷酸化可以產(chǎn)生的增強(qiáng)電流）可能也與電場(chǎng)對(duì)多肽的局部拉伸有關(guān)。
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本文還觀測(cè)到了非常有趣的振蕩電流現(xiàn)象；當(dāng)存在帶正電荷的氨基酸殘基時(shí)，這類振蕩電流會(huì)消失，也從側(cè)面說明了電荷對(duì)多肽運(yùn)動(dòng)行為的重要影響。因此，本文進(jìn)行了非常系統(tǒng)的可控多肽過孔研究，與此前的兩篇文獻(xiàn)進(jìn)行印證，證明了多肽在檢測(cè)區(qū)拉伸的重要性。
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在將來，為了能成功區(qū)分出不同的氨基酸，一方面可以改善納米孔的分辨率，另一方面可以利用電滲流的方法將多肽鏈拉伸，這些改進(jìn)將為低成本單分子肽測(cè)序技術(shù)的開發(fā)鋪平道路，在科學(xué)發(fā)現(xiàn)和臨床應(yīng)用方面擁有巨大的潛力。
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論文信息
?Controlled movement of ssDNA conjugated peptide through Mycobacterium smegmatis porin A (MspA) nanopore by a helicase motor for peptide sequencing applicationZhijie Chen, Zhenqin Wang, Yang Xu, Xiaochun Zhang, Boxue Tian and Jingwei Bai*（白凈衛(wèi)，清華大學(xué)）
Chem. Sci., 2021
http://doi.org/10.1039/D1SC04342K
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原文鏈接：https://pubs.rsc.org/en/Content/ArticleLanding/2021/SC/D1SC04342K?
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