雷曉光課題組與合作者研究發(fā)現(xiàn)植物利用獨特的天然產物實現(xiàn)“不戰(zhàn)而屈人之兵”的抗菌策略
2020年4月8日，北京大學化學與分子工程學院雷曉光課題組與合作者中國科學院遺傳與發(fā)育生物學研究所周儉民課題組、國家蛋白質中心楊靖課題組共同在Cell子刊《Cell Host＆Microbe》雜志上發(fā)表了題為“An Arabidopsis secondary metabolite directly targets expression of the bacterial type III secretion system to inhibit bacterial virulence”的文章，闡明了植物通過產生異硫氰酸酯類小分子天然產物Sulforaphane（SFN）特異性抑制植物病原菌III型分泌系統(tǒng)，從而達到“不戰(zhàn)而屈人之兵”的有效抗菌策略。該研究發(fā)現(xiàn)了植物內源天然產物在植物與微生物相互作用中所扮演的重要角色，揭示了新穎的生物作用機制，為植物保護提供了新的研究思路。
植物產生的硫代葡萄糖苷類天然產物因為其獨特的生物活性受到廣泛關注。硫苷是植物體內合成的含氮、硫的次生代謝化合物，在十字花科植物中含量較高。硫苷通過芥子酶的作用可形成包括異硫氰酸酯（Isothiocyanate）在內的一系列下游天然產物，在植物抵御病原菌侵染以及昆蟲的取食中發(fā)揮著重要的作用。除了在植物防衛(wèi)中起到重要作用，異硫氰酸酯類化合物也被證實具有很好的抗腫瘤活性。前期大量的流行病學研究顯示：食用富含異硫氰酸酯類化合物的十字花科植物如卷心菜、西蘭花等，能有效地降低胃腸道癌癥風險。因此，這類化合物一直被認為是西蘭花等蔬菜產生癌癥預防功效的主要活性成分（圖一）。但是，這類植物內源性天然產物對于植物自身生理、病理過程的具體作用機制尚不清楚。
圖一：異硫氰酸酯（Isothiocyanate）的化學結構和其被報道過的生物活性
（圖片摘自：https://www.healthwriting.com/wp-content/uploads/sulforophane-featured.jpg）
許多植物天然產物通過抑制細菌的生命活動殺死細菌，這一過程對有害和有益微生物都具有殺傷作用，因此容易導致細菌耐藥性的產生。前期研究表明，植物有可能通過一些未知的機制，特異性抑制植物病原菌III型分泌系統(tǒng)相關基因的表達，使得植物病原菌無法通過III型分泌系統(tǒng)分泌致病效應蛋白，從而起到降低病原菌的致病性。因此，探究植物如何通過讓病原菌的致病“武器”III型分泌系統(tǒng)失效，將病原菌與共生菌區(qū)別開來，達到“不戰(zhàn)而屈人之兵”的抗菌效果，已經成為植物生物學研究領域一個很重要的科學問題。
雷曉光課題組一直致力于天然產物合成與化學生物學研究，主要聚焦在揭示植物來源天然產物獨特的生物活性機制，開發(fā)有效的化學合成與生物合成策略，高效制備結構復雜的天然產物分子，以及開展天然產物創(chuàng)新藥物研究。在本課題中，雷曉光課題組與周儉民課題組合作，利用生物活性導向的天然產物分離策略，首先觀察到擬南芥的醇提物具有抑制丁香假單胞菌III型分泌系統(tǒng)相關基因（效應蛋白、轉錄調控因子）的轉錄以及表達的作用，通過多次化學分離、純化過程得到了具有最強抑制活性的天然產物分子。通過核磁共振、質譜等化學結構表征手段，鑒定出該天然產物分子為Sulforaphane（SFN）。進一步生物驗證表明：在SFN作用下，III型分泌系統(tǒng)分泌的效應蛋白α-AvrPto的表達水平顯著下降，相關基因的轉錄水平也隨著SFN濃度升高而降低。在擬南芥植株上對SFN生物合成途徑進行敲除后，擬南芥胞間液中不再檢出SFN，與之相對應的是敲除生物合成途徑的突變株比野生型更易感病，從植株水平確證了SFN作為擬南芥防御分子的作用（圖二）。
圖二：通過生物活性導向的天然產物分離鑒定出Sulforaphane（SFN）可以抑制病原菌三型分泌系統(tǒng)
（圖片摘自：Wang et al., 2020, Cell Host & Microbe 27, 601–613）
為了闡明SFN的明確生物作用機制，他們進一步通過轉錄組分析以及化學蛋白質組學鑒定出了SFN分子的相互作用靶點蛋白和具體作用位點（圖三）。SFN具有親電性的異硫氰基，能夠通過加成反應共價地結合半胱氨酸（Cys）上的硫醇。因此他們采取了化學蛋白質組學技術中的定量硫醇反應活性分析技術(Quantitative Thiol Reactivity Profiling, QTRP)，全局性以及位點特異性地尋找SFN結合的半胱氨酸殘基。首先他們將Pst DC3000用SFN處理2h（對照組不加SFN）后,分別提取全蛋白。接著利用具有硫醇反應性的生物正交反應探針，對半胱氨酸殘基進行一個全局性的標記，之后酶切成肽段。用輕重同位素標記的可光解的疊氮生物素與SFN處理組和未處理組的肽段進行生物正交反應，并用鏈霉親和素富集。最后光解后獲得輕重同位素標記的肽段，通過LC-MS分析。在SFN處理組中標記的特定的含半胱氨酸肽段數(shù)量減少，則說明SFN對特定的半胱氨酸殘基的結合。通過這樣的策略，他們鑒定出了在III型分泌系統(tǒng)調控轉錄因子HrpS的209位存在著SFN的修飾（圖三）。進一步實驗證明，SFN共價結合了HrpS的209位半胱氨酸，阻止了HrpS和HrpR的結合。而HrpS和HrpR只有結合形成異源六聚體，才能激活hrpL基因的表達。HrpL作為選擇性σ因子，誘導丁香假單胞菌III型分泌系統(tǒng)相關基因的表達。進一步研究還發(fā)現(xiàn)該類天然產物只對植物治病菌有抑制作用，而對于很多植物共生菌沒有明顯抑制作用。
圖三：利用化學蛋白質組學發(fā)現(xiàn)SFN靶點蛋白
（圖片摘自：Wang et al., 2020, Cell Host & Microbe 27, 601–613）
綜上所述，該合作團隊首先通過活性導向天然產物分離鑒定出了擬南芥中異硫氰酸酯類化合物SFN,確證了其抑制植物病原菌III型分泌系統(tǒng)相關基因表達的活性。進一步通過化學蛋白質組學鑒定出SFN的靶點蛋白和作用位點，表明了SFN直接結合HrpS蛋白209位的半胱氨酸殘基，抑制HrpS和HrpR六聚體的形成，從而抑制了HrpL的表達，使得植物病原菌III性分泌系統(tǒng)相關基因表達受到抑制。通過該生物機制，SFN分子能夠特異性的降低病原菌的致病性，而不對益生菌產生毒性，起到了靶向防御的作用（圖四）。孫子曰：“凡用兵之法，全國為上，破國次之”，通過將病原菌與益生菌區(qū)別開來并“解除武裝”，植物能夠最大限度的保證自身的正常生理活動不受影響，達到“不戰(zhàn)而屈人之兵”的抗菌效果。
圖四：SFN的生物作用機制總結
（圖片摘自：Wang et al., 2020, Cell Host & Microbe 27, 601–613）
在該工作中王偉博士和楊靖研究員為論文的共同第一作者，雷曉光教授和周儉民研究員為共同通訊作者。褚金芳研究團隊和白洋研究團隊也參與了該項工作。該研究工作得到了國家自然科學基金、國家重點研發(fā)計劃、中國科學院國際合作重點項目、北京市“卓越青年科學家計劃”、北京分子科學國家研究中心、植物基因組學國家重點實驗室以及北大-清華生命科學聯(lián)合中心的資助。
論文鏈接：https://www.cell.com/cell-host-microbe/fulltext/S1931-3128(20)30168-2
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