宋保亮/仇文衛(wèi)/趙曉璐揭示SMO蛋白膽固醇化修飾的生化反應(yīng)機(jī)制
近日，武漢大學(xué)宋保亮、趙曉璐和華東師范大學(xué)仇文衛(wèi)課題組合作在Cell Research發(fā)表了題為《Cholesterylation of Smoothened is a calcium-accelerated autoreaction involving an intramolecular ester intermediate/鈣離子促進(jìn)Smoothened蛋白通過分子內(nèi)轉(zhuǎn)酯反應(yīng)形成膽固醇共價(jià)修飾》的研究論文，闡明了SMO蛋白的膽固醇修飾是一個由鈣離子加速的自發(fā)反應(yīng)，揭示了鈣離子在Hedgehog信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的重要作用，并證明膽固醇修飾對于SMO功能發(fā)揮至關(guān)重要【1】。
Hedgehog（Hh）信號通路是一種從果蠅到哺乳動物高度保守的信號通路。Hh通路的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)主要由三個蛋白完成——分泌蛋白Hh、Hh受體Patched 1（PTCH1）以及G蛋白偶聯(lián)受體Smoothened（SMO）。Hh信號通路在胚胎發(fā)育和成體器官穩(wěn)態(tài)維持過程中起重要作用，而異常激活的Hh信號通路會引起多種腫瘤。當(dāng)細(xì)胞外Hh濃度升高時(shí)，Hh結(jié)合PTCH1，解除PTCH1對于SMO的抑制作用，使得定位于細(xì)胞內(nèi)囊泡的SMO轉(zhuǎn)移到初級纖毛，SMO進(jìn)一步將胞外信號轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞內(nèi)激活GLI等轉(zhuǎn)錄因子【2】。
2017年宋保亮與仇文衛(wèi)合作首次報(bào)道了SMO蛋白被膽固醇共價(jià)修飾。人SMO蛋白通過其胞外cysteine-rich domain（CRD）中第95位天冬氨酸側(cè)鏈羧基與膽固醇3β羥基形成酯鍵【3】。但SMO蛋白膽固醇共價(jià)修飾的化學(xué)反應(yīng)機(jī)理和調(diào)控機(jī)制尚不清楚。
在本工作中，研究人員首先在體外重構(gòu)了SMO蛋白的膽固醇化共價(jià)修飾反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)該反應(yīng)不依賴于額外的能量和其它蛋白，但鈣離子能增強(qiáng)膽固醇探針對SMO的共價(jià)修飾。進(jìn)一步質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)修飾位點(diǎn)D95會首先與臨近的Y130側(cè)鏈形成內(nèi)酯，鈣離子通過促進(jìn)D95-Y130內(nèi)酯向D95-膽固醇酯的轉(zhuǎn)酯反應(yīng)，增強(qiáng)SMO的膽固醇修飾（圖1）。
圖1. SMO膽固醇化共價(jià)修飾的化學(xué)反應(yīng)機(jī)理
隨后，研究人員發(fā)現(xiàn)當(dāng)細(xì)胞受到Hh信號刺激時(shí)，SMO早期內(nèi)體囊泡中的鈣離子濃度明顯上升。進(jìn)一步篩選發(fā)現(xiàn)Hh信號通過激活STIM-ORAI1鈣離子通道介導(dǎo)胞外鈣離子內(nèi)流（圖2）。
圖2. Hh促進(jìn)SMO膽固醇化修飾的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑
為探究膽固醇共價(jià)修飾對于激活SMO的重要性，研究人員基于SMO結(jié)構(gòu)構(gòu)建了SMO(D95E)突變。該突變保留SMO結(jié)合膽固醇的能力，但不能被膽固醇共價(jià)修飾。在細(xì)胞水平上，SMO(D95E)突變體極大降低下游Hh信號通路活性。同源位點(diǎn)(SmoD99E)敲入純合子小鼠表現(xiàn)出嚴(yán)重發(fā)育遲緩，導(dǎo)致胚胎致死，說明膽固醇修飾缺失會完全抑制SMO蛋白的活性。
武漢大學(xué)高等研究院的胡傲博士和華東師范大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院博士研究生張竟贊為本論文共同第一作者。宋保亮教授、趙曉璐副教授和仇文衛(wèi)教授為通訊作者。該研究工作得到了基金委“生物大分子動態(tài)修飾與化學(xué)干預(yù)”重大研究計(jì)劃資助。
參考文獻(xiàn)
1. Hu A, Zhang JZ, Wang J, Li CC, Yuan M, Deng G, Lin ZC, Qiu ZP, Liu HY, Wang XW, Wei PC, He X, Zhao X, Qiu WW, Song BL. Cholesterylation of Smoothened is a calcium-accelerated autoreaction involving an intramolecular ester intermediate. Cell Research. 0:1–14; https://doi.org/10.1038/s41422-022-00622-0 (2022).
2. Hu A, Song BL. The interplay of Patched, Smoothened and cholesterol in Hedgehog signaling. Curr Opin Cell Biol. 61:31-38 (2019).
3. Xiao X, Tang JJ, Peng C, Wang Y, Fu L, Qiu ZP, Xiong Y, Yang LF, Cui HW, He XL, Yin L, Qi W, Wong CC, Zhao Y, Li BL, Qiu WW, Song BL. Cholesterol Modification of Smoothened Is Required for Hedgehog Signaling. Mol Cell. 66(1):154-162 (2017).
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