饒毅實(shí)驗(yàn)室的生物化學(xué)研究：分離純化揭示AMPK及其相關(guān)激酶的蛋白激酶
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生物化學(xué)，既有自己的學(xué)術(shù)問題，也是一種研究途徑。通過生物化學(xué)的分離純化，發(fā)現(xiàn)分子間的相互生物化學(xué)關(guān)系，是生物學(xué)研究的最重要途徑之一。
以往，饒毅實(shí)驗(yàn)室長(zhǎng)期以遺傳學(xué)、分子生物學(xué)研究神經(jīng)生物學(xué)和發(fā)育生物學(xué)問題。
自2011年以來，實(shí)驗(yàn)室集中一部分精力和研究人員在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)建立了生物化學(xué)分離純化方法。
起點(diǎn)是用于神經(jīng)生物學(xué)的問題，但可能涉及其他生物學(xué)問題。
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2022年4月10日，美國(guó)生物化學(xué)和分子生物學(xué)會(huì)主辦的《生物化學(xué)雜志》，在線發(fā)表了兩篇饒實(shí)驗(yàn)室的生物化學(xué)文章，其內(nèi)容完全是生物化學(xué)。
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這些工作的起源在于神經(jīng)生物學(xué)。2016年，日本筑波的柳澤正史(Masashi Yanagisawa)發(fā)表一篇文章，他們通過小鼠的遺傳篩選，找到一個(gè)影響睡眠的基因，它編碼SIK3蛋白激酶。他們發(fā)現(xiàn)SIK3功能提高后，睡眠增加。他們發(fā)現(xiàn)SIK3的一個(gè)氨基酸位點(diǎn)(S556)被常見蛋白激酶PKA所磷酸化，S556被磷酸化后，SIK3功能被抑制。
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饒毅實(shí)驗(yàn)室的研究生李揚(yáng)和劉玉祥等發(fā)現(xiàn)，SIK3的另一位點(diǎn)(T221)有重要功能：它的磷酸化提高SIK3的功能(李揚(yáng)等，投稿中)。
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SIK3屬于AMPK家族。AMPK家族目前被一般認(rèn)為有14個(gè)成員。AMPK參與重要的生物學(xué)過程，包括代謝調(diào)控等。
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2003年和2004年，四個(gè)實(shí)驗(yàn)室發(fā)表5篇文章，認(rèn)為AMPK的上游激酶是LKB1，后者此前被發(fā)現(xiàn)參與抑制多種腫瘤。
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饒毅實(shí)驗(yàn)室的劉玉祥等發(fā)現(xiàn)，LKB1確實(shí)能夠磷酸化AMPK的特定位點(diǎn)(T172)，無論是哺乳動(dòng)物中表達(dá)后拉下來的LKB1、還是細(xì)菌表達(dá)的LKB1都能磷酸化AMPK的T172。但是，只有哺乳動(dòng)物中表達(dá)后拉下來的LKB1可以磷酸化SIK3的T221，而細(xì)菌表達(dá)的LKB1不能磷酸化SIK3的T221。
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饒毅實(shí)驗(yàn)室的劉子怡等在果蠅和小鼠制造LKB1的基因的突變，發(fā)現(xiàn)LKB1表達(dá)量減少后，果蠅和老鼠的睡眠都減少，說明LKB1促進(jìn)睡眠(劉子怡等，投稿中)。
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用哺乳動(dòng)物體外培養(yǎng)細(xì)胞(人的HEK細(xì)胞)和小鼠腦，劉玉祥進(jìn)行柱層析后發(fā)現(xiàn)，除了LKB1，還有其他磷酸化SIK3和AMPK的活性。
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他帶領(lǐng)崔云鳳等，用50升的懸浮培養(yǎng)HEK細(xì)胞，用了六種色譜柱，成功地分離到了有活性的組分。
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進(jìn)一步的蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析顯示，其中有六個(gè)激酶。當(dāng)這六個(gè)激酶被分別用基因表達(dá)后，只有MST3和MST4能夠磷酸化SIK3-T221位點(diǎn)，而其他四個(gè)不能。
MST3不僅能夠磷酸化SIK3-T221位點(diǎn)，而且能夠提高SIK3本身的蛋白激酶活性(作用于其下游的HDAC4)。劉玉祥、王濤等附帶顯示，裴鋼實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)的小鼠MST3b也與大家常見的MST3一樣，有類似的對(duì)SIK3 T221的活性。MST有五個(gè)成員(1-5)，SIK有三個(gè)成員(1-3)。劉玉祥等發(fā)現(xiàn)，MST的所有五個(gè)成員能夠磷酸化SIK的所有三個(gè)成員。他們通過細(xì)菌表達(dá)的五個(gè)MST也都能夠磷酸化AMPK的T172。
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劉玉祥（研究生/博士后）、王濤（研究生）、崔云鳳（技術(shù)員）、高勝賢（博士后）、饒毅等從而得到體外生物化學(xué)證據(jù)，提示五個(gè)MST是SIK和AMPK的蛋白激酶。
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饒毅實(shí)驗(yàn)室基因敲除小鼠的MST3之后，發(fā)現(xiàn)鼠腦還有磷酸化AMPK-T172和SIK3-T221的活性。劉玉祥敲除HEK細(xì)胞的MST3之后，還有不是LKB1的活性磷酸化AMPK-T172和SIK3-T221。
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劉玉祥再次進(jìn)行蛋白質(zhì)分離純化，發(fā)現(xiàn)CaMKK1和2。這兩個(gè)激酶以前被人發(fā)現(xiàn)確實(shí)可以磷酸化AMPK-T172，只是沒有LKB1那么引人矚目。
劉玉祥發(fā)現(xiàn)，除外CaMKK，在HEK里面還有活性可以磷酸化AMPK-T172和SIK3-T221。劉玉祥等第三次分離純化，發(fā)現(xiàn)MAP4K5可以磷酸化AMPK-T172和SIK3-T221。
MST3和MAP4K5，無論是細(xì)菌表達(dá)的還是哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的，都能夠磷酸化現(xiàn)在通行已知的14個(gè)AMPK相關(guān)激酶。其中有些有磷酸化抗體，有些用蛋白質(zhì)質(zhì)譜鑒定磷酸化。
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而MAP4K5與MST同屬于哺乳類中類似酵母sterile 20蛋白激酶的一個(gè)亞家族。STE20亞家族有28個(gè)成員。劉玉祥、王濤、崔云鳳等把28個(gè)蛋白激酶全部用細(xì)菌和HEK表達(dá)。發(fā)現(xiàn)其中十幾到二十幾個(gè)能夠磷酸化AMPK和SIK3。這些激酶對(duì)于兩個(gè)底物AMPK和SIK3的作用不盡相同，而不同的STE20激酶的作用也不盡相同。
自2016年以來，劉玉祥（研究生/博士后）、王濤（研究生）、崔云鳳（技術(shù)員）、李超逸（博士后）、姜麗芬（博士后）、饒毅通過體外的生物化學(xué)提示，十幾二十個(gè)STE20蛋白激酶對(duì)AMPK和SIK3有磷酸化作用。
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這兩篇文章的強(qiáng)處在于：通過少見的三輪生物化學(xué)分離純化，發(fā)現(xiàn)重要的蛋白激酶AMPK及其類似激酶，可以被STE20家族的多個(gè)成員所磷酸化。
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這兩篇文章的弱點(diǎn)在于：尚不清楚這些體外生物化學(xué)發(fā)現(xiàn)的體內(nèi)生理學(xué)意義。例如，不清楚STE20對(duì)AMPK的磷酸化是否調(diào)節(jié)代謝。也不清楚STE20的家族成員能否調(diào)節(jié)睡眠。
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如果STE20-AMPK上下游關(guān)系確實(shí)參與很多、很重要的生理學(xué)過程，這些發(fā)現(xiàn)就是重要的突破性發(fā)現(xiàn)。
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如果STE20-AMPK上下游關(guān)系在體內(nèi)不參與重要生理學(xué)過程，這些發(fā)現(xiàn)就是體外的優(yōu)美的生物化學(xué)，但類似水中的月，除了觀賞，沒有什么用處。
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Liu YX, Wang TV, Cui YF, Gao SX and Rao Y (2022). Biochemical purification uncovers mammalian sterile 3 (MST3) as a new protein kinase for multifunctional protein kinases AMPK and SIK3. J Biol Chem 2022.101929.
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Liu YX, Wang TV, Cui YF, Li CY, Jiang LF and Rao Y (2022). STE20 phosphorylation of AMPK related kinases revealed by biochemical purifications combined with genetics. J Biol Chem 2022.101928.
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