陳興課題組揭示軍團(tuán)菌來源的新型O-糖基轉(zhuǎn)移酶機(jī)理
2019年1月8日，北京大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院、北大-清華生命科學(xué)聯(lián)合中心陳興教授課題組在Nature Chemical Biology雜志在線發(fā)表了題為“Legionella effector SetA as a general O-glucosyltransferase for eukaryotic proteins”（DOI: 10.1038/s41589-018-0189-y）的研究論文，報(bào)道通過化學(xué)酶法標(biāo)記策略，實(shí)現(xiàn)了對嗜肺軍團(tuán)菌效應(yīng)蛋白糖基轉(zhuǎn)移酶SetA的蛋白底物鑒定，并闡明了SetA的底物選擇機(jī)理，為糖蛋白的人工合成提供了一種有力的工具。
糖基化修飾是一種廣泛存在且重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾，由糖基轉(zhuǎn)移酶催化形成?？贵w、疫苗等許多臨床治療性蛋白質(zhì)都具有特異性糖基化修飾，且對蛋白活性至關(guān)重要?；谔腔D(zhuǎn)移酶的化學(xué)酶法合成方法，是獲得均一糖蛋白的有效手段之一。因此，找尋性質(zhì)優(yōu)良的各種糖基轉(zhuǎn)移酶十分關(guān)鍵。對比真核細(xì)胞，細(xì)菌來源的糖基轉(zhuǎn)移酶具有易表達(dá)純化和催化產(chǎn)率高等優(yōu)良性質(zhì)，常被改造為人工合成糖蛋白的工具酶。然而，蛋白O-連接糖基化修飾在原核生物與真核生物之間并不保守，這成為了利用細(xì)菌糖基化系統(tǒng)生產(chǎn)真核生物O-糖蛋白的一大瓶頸。為了解決這個問題，陳興教授課題組對病原菌-宿主相互作用中的蛋白質(zhì)糖基化進(jìn)行了探索。
某些病原菌入侵宿主細(xì)胞后，會分泌具有糖基轉(zhuǎn)移酶活性的效應(yīng)蛋白。這些效應(yīng)蛋白往往利用宿主的糖供體，并且修飾宿主的靶蛋白。因此，對這類糖基轉(zhuǎn)移酶的工程化，可為實(shí)現(xiàn)真核生物O-糖蛋白的合成提供新的有效策略。嗜肺軍團(tuán)菌效應(yīng)蛋白SetA具有O-葡萄糖轉(zhuǎn)移酶活性，然而其底物蛋白尚未被鑒定。陳興課題組首先開發(fā)了能夠?qū)崿F(xiàn)特異性標(biāo)記和選擇性富集的化學(xué)酶法策略。他們設(shè)計(jì)被SetA利用的生物正交基團(tuán)修飾的糖供體（尿苷二磷酸-6-疊氮-葡萄糖，UDP-6AzGlc），將疊氮葡萄糖6AzGlc轉(zhuǎn)移至底物蛋白。通過點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)，與可切割生物素探針連接，實(shí)現(xiàn)對底物蛋白的選擇性富集和位點(diǎn)特異性質(zhì)譜鑒定(下圖)。質(zhì)譜分析鑒定到分布于276個蛋白的317個O-glucose修飾位點(diǎn)。天然糖供體標(biāo)記及軍團(tuán)菌侵染實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證了SetA可以修飾眾多的底物蛋白。
化學(xué)酶法標(biāo)記策略流程示意圖
進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)被修飾蛋白具有S/T#-X-L-P/G (#為修飾氨基酸)序列保守性。核心催化結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)模型表面，糖供體結(jié)合口袋鄰近處的疏水區(qū)域參與了SetA的底物選擇。隨后，研究人員將SetA選擇性識別的S/T-X-L-P/G保守性序列，開發(fā)為O-glucosylation 標(biāo)簽 (GlcTag)，實(shí)現(xiàn)了真核生物蛋白的位點(diǎn)特異性O(shè)-糖基化修飾(下圖)。
SetA識別S/T-X-L-P/G保守序列
綜上所述，這項(xiàng)研究開發(fā)了化學(xué)酶法標(biāo)記策略，實(shí)現(xiàn)了對軍團(tuán)菌效應(yīng)蛋白糖基轉(zhuǎn)移酶SetA的底物蛋白鑒定，揭示了SetA的底物修飾具有S/T-X-L-P/G序列選擇性。首次發(fā)現(xiàn)了原核生物中廣譜O-糖基化系統(tǒng)，為糖蛋白的人工合成提供了有力的工具。該化學(xué)酶法標(biāo)記富集策略可推廣應(yīng)用到多種糖基轉(zhuǎn)移酶的底物蛋白鑒定，促進(jìn)更多的糖合成工具酶的開發(fā)，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)各種糖蛋白的精準(zhǔn)合成。
北大-清華生命科學(xué)聯(lián)合中心博士研究生高玲為本論文第一作者。陳興教授通訊聯(lián)系作者。北大化學(xué)院來魯華教授，北京生命科學(xué)研究所邵峰研究員和北大生科院肖俊宇研究員參與了該研究。該研究工作得到了國家自然科學(xué)基金委、科技部、北大-清華生命科學(xué)聯(lián)合中心的資助。
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