生命學(xué)院姚駿課題組發(fā)現(xiàn)突觸囊泡停泊初始態(tài)發(fā)生的過程及其分子機(jī)制
神經(jīng)元之間的信號(hào)傳遞是大腦最基礎(chǔ)的生理活動(dòng)，當(dāng)動(dòng)作電位到達(dá)突觸時(shí)，突觸小泡在毫秒級(jí)的時(shí)間內(nèi)釋放神經(jīng)遞質(zhì)，從而使動(dòng)作電位快速跨突觸傳遞，這一過程受到特定蛋白質(zhì)機(jī)器的精密調(diào)控。突觸小泡與質(zhì)膜的融合可分為停泊（Docking）、點(diǎn)火（Priming）和融合（Fusion）三個(gè)過程。停泊作為囊泡融合的起始階段，其重要意義在于大腦的神經(jīng)活動(dòng)并不是以單個(gè)的動(dòng)作電位發(fā)生的，而是以十分高頻率的一串動(dòng)作電位的方式進(jìn)行，這就要求突觸有一批能快速釋放的囊泡在時(shí)刻準(zhǔn)備著。囊泡的即刻可釋放池（RRP）保障了這一功能，并作為決定突觸強(qiáng)度的首要因素，影響著神經(jīng)元和大腦許多重要的功能，而停泊這一過程是囊泡進(jìn)入即刻可釋放池的初始步驟，其如何發(fā)生、由誰介導(dǎo)，目前尚無定論。
在文獻(xiàn)報(bào)道中，Synaptotagmin-1 (Syt1)和三個(gè)SNARE蛋白形成的復(fù)合物，是介導(dǎo)突觸小泡停泊的潛在候選分子機(jī)器。SNARE 復(fù)合物由三個(gè)蛋白組成，是囊泡與質(zhì)膜融合的最小蛋白機(jī)器。Syt1則是動(dòng)作電位誘發(fā)突觸小泡釋放的鈣離子感受器。在經(jīng)典的囊泡融合模型中，三個(gè)SNARE蛋白在遠(yuǎn)端結(jié)合形成一個(gè)Z字型的拉鏈，隨著4個(gè)平行α螺旋束結(jié)構(gòu)的形成，囊泡自遠(yuǎn)而近地完成了停泊-點(diǎn)火（Docking-Priming）的過程，進(jìn)入準(zhǔn)備釋放（release ready）的狀態(tài)，這是囊泡停泊的傳統(tǒng)模型，即SNARE complex介導(dǎo)了囊泡的停泊。然而，這一模型存在較大爭議，原因在于兩方面。一方面，停泊的形態(tài)學(xué)定義（即囊泡須緊貼于質(zhì)膜）并不準(zhǔn)確，停泊究竟在什么位置啟動(dòng)，一直是懸而未決的問題。另一方面，在蛋白機(jī)器研究上，多重基因敲除動(dòng)物模型不但耗時(shí)耗力，而且存在很多發(fā)育缺陷與代償作用帶來的負(fù)面效應(yīng)。
為解決上述技術(shù)障礙，姚駿課題組開發(fā)了在體高效沉默多重基因的CRISPRi技術(shù)，在神經(jīng)元中，高效特異地對基因單獨(dú)或者聯(lián)合進(jìn)行條件性敲低，在神經(jīng)元內(nèi)構(gòu)建出類體外重構(gòu)的環(huán)境。另外，課題組結(jié)合高壓冷凍（High pressure freezing）與電子斷層掃描（TEM tomography）技術(shù)，得到接近真實(shí)狀態(tài)下神經(jīng)元突觸不同基因敲除的三維電鏡數(shù)據(jù)。從而對突觸小泡的停泊過程進(jìn)行精確的電鏡觀測和定義。作者首先對SNARE復(fù)合物進(jìn)行了多重敲低，發(fā)現(xiàn)在離突觸前膜2-12 nm的范圍內(nèi)，突觸小泡出現(xiàn)了數(shù)倍于對照組的聚集。在SNARE 全敲的基礎(chǔ)上引入Syt1敲低后，突觸小泡的聚集現(xiàn)象消失，這說明Syt1可能是將囊泡圈定在2-12 nm范圍內(nèi)的關(guān)鍵因素。隨后的一系列實(shí)驗(yàn)全面證實(shí)了Syt1的這一功能。進(jìn)一步，作者們開始探索Syt1 啟動(dòng)突觸囊泡停泊的分子伴侶。脂質(zhì)體共沉淀實(shí)驗(yàn)（co-sedimentation）表明，Syt1 可以通過其C2B domain 上的K325-K327模塊與PIP2結(jié)合，突變這一模塊（Syt1KA），Syt1則無法與PIP2相互作用。而Syt1與SNARE結(jié)合有兩個(gè)界面，同時(shí)突變這些界面位點(diǎn)（Syt1Q/LLQQ），可以有效地減弱Syt1與SNARE的結(jié)合。作者發(fā)現(xiàn)，在Syt1/SNARE敲低組中引入Syt1KA突變體，并不能讓突觸小泡被圈定在2-12 nm 范圍內(nèi)，而Syt1Q/LLQQ卻可以執(zhí)行這一功能。所以，Syt1很可能通過與PIP2結(jié)合來啟動(dòng)突觸小泡停泊。針對PIP2的功能研究，作者們使用了四種不同的方法來降低或提升突觸前膜上PIP2的含量，包括PIP2合成酶PIP5K三個(gè)亞型的三重敲降、PIP2水解酶Synaptojanin-1 (Synj)的增強(qiáng)型突變，以及代謝型谷氨酸受體mGluN5的拮抗劑和激動(dòng)劑處理。這四種方法均有效地改變了突觸前膜上PIP2的含量。此外，電鏡分析結(jié)果表明，降低PIP2含量可抑制Syt1在2-12 nm處啟動(dòng)突觸小泡的停泊，而提升PIP2含量則無明顯效應(yīng)。這一系列實(shí)驗(yàn)，證明了PIP2是Syt1在膜上的分子伴侶，它們相互作用、共同啟動(dòng)了突觸小泡的Docking。
綜合來看，本項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)Syt1結(jié)合PIP2介導(dǎo)了突觸小泡的停泊的起始過程，其作用位置位于距質(zhì)膜約12 nm處, 該過程不依賴于SNARE 復(fù)合物，且優(yōu)先于SNARE 復(fù)合物的形成。通過這一研究，作者們發(fā)現(xiàn)了Docking起始態(tài)發(fā)生的位置和分子機(jī)制，為理解神經(jīng)遞質(zhì)的釋放過程，尤其是理解大腦在受到高頻生理刺激時(shí)神經(jīng)元保持快速高效的響應(yīng)，做出了重要貢獻(xiàn)。
圖一 突觸囊泡Docking的動(dòng)態(tài)過程及其分子機(jī)制
此研究工作于2021年3月16日在線發(fā)表于Cell Reports雜志。清華大學(xué)生命學(xué)院姚駿研究員為本文的通訊作者。生命學(xué)院博士生陳運(yùn)、王穎菡及生命學(xué)院已出站博士后鄭毅為共同第一作者。清華大學(xué)生命學(xué)院李雪明研究員及其實(shí)驗(yàn)室李美靜博士，姚駿課題組王秋文博士、博士生汪兵、付崇雷、劉要南為本項(xiàng)研究工作做出了重要貢獻(xiàn)。清華大學(xué)冷凍電鏡平臺(tái)李英博士和胡曉風(fēng)、細(xì)胞影像平臺(tái)王文娟博士、NIBS何萬中研究員和尼康公司李勛博士為本研究提供了重要幫助。
全文鏈接：https://www.cell.com/cell-reports/fulltext/S2211-1247(21)00156-X
版權(quán)與免責(zé)聲明：本網(wǎng)頁的內(nèi)容由收集互聯(lián)網(wǎng)上公開發(fā)布的信息整理獲得。目的在于傳遞信息及分享，并不意味著贊同其觀點(diǎn)或證實(shí)其真實(shí)性，也不構(gòu)成其他建議。僅提供交流平臺(tái)，不為其版權(quán)負(fù)責(zé)。如涉及侵權(quán)，請聯(lián)系我們及時(shí)修改或刪除。郵箱：sales@allpeptide.com