生命學(xué)院陳春來(lái)課題組合作揭示糖基化酶AlkD找尋和識(shí)別靶標(biāo)的機(jī)制
2020年8月20日，清華大學(xué)生命科學(xué)院陳春來(lái)課題組、香港科技大學(xué)黃旭輝課題組、北京大學(xué)趙新生課題組和中科院福建物質(zhì)結(jié)構(gòu)研究所張璐研究員合作在《美國(guó)科學(xué)院院報(bào)》（PNAS）雜志發(fā)表了題為“利用掃描FRET-FCS和馬爾可夫態(tài)模型揭示糖基化酶AlkD找尋和識(shí)別靶標(biāo)的機(jī)制”（Target search and recognition mechanisms of glycosylase AlkD revealed by scanning FRET-FCS and Markov State Models）的文章。
DNA結(jié)合蛋白識(shí)別DNA上特異性位點(diǎn)是基因復(fù)制、DNA損傷修復(fù)、表達(dá)調(diào)控和CRISPR-Cas適應(yīng)性免疫等重要生理生化過(guò)程的基礎(chǔ)。然而DNA結(jié)合蛋白如何在包含幾百萬(wàn)甚至幾十億個(gè)堿基對(duì)的基因組中高效并準(zhǔn)確的識(shí)別其特異性結(jié)合位點(diǎn)，仍然是個(gè)未解之謎。DNA糖基化酶是一類極其重要的DNA結(jié)合蛋白，作為DNA修復(fù)酶，它的功能是識(shí)別基因組上的DNA損傷位點(diǎn)并介導(dǎo)相應(yīng)的修復(fù)過(guò)程，在維持基因組穩(wěn)定性中發(fā)揮著重要的功能。捕捉DNA糖基化酶在搜尋靶標(biāo)過(guò)程中的動(dòng)力學(xué)信息，對(duì)于闡明糖基化酶介導(dǎo)的DNA修復(fù)過(guò)程的分子機(jī)制和生理功能都是必不可少的。
人們推測(cè)糖基化酶在DNA上一維擴(kuò)散時(shí)存在著“高速低準(zhǔn)確度”和“低速高準(zhǔn)確度”兩種靶標(biāo)搜尋模式，其通過(guò)在兩種搜尋模式之間切換實(shí)現(xiàn)找尋靶標(biāo)的高效和高準(zhǔn)確度。迄今為止，人們并不了解糖基化酶等只存在單一結(jié)構(gòu)域的DNA結(jié)合蛋白是如何實(shí)現(xiàn)在“高速低準(zhǔn)確度”和“低速高準(zhǔn)確度”搜尋模式之間切換的。究其原因是由于目前測(cè)量技術(shù)的空間分辨率和時(shí)間分辨率有限，研究者僅能直接捕捉到糖基化酶等單結(jié)構(gòu)域蛋白在DNA上的高速搜尋模式，而低速搜尋模式以及DNA結(jié)合蛋白在兩種搜尋模式之間的切換過(guò)程則沒(méi)有直接的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。
針對(duì)以上技術(shù)問(wèn)題，本文發(fā)展了新型高時(shí)間分辨率（亞微秒）和高空間分辨率（亞納米）的掃描熒光共振能量轉(zhuǎn)移相關(guān)光譜技術(shù)（scanning FRET-FCS）。利用這一新技術(shù)，他們不但捕捉到糖基化酶AlkD在雙鏈DNA（dsDNA）上的快速一維擴(kuò)散模式，還首次捕捉到了AlkD一維擴(kuò)散的慢搜尋模式（圖1）。從中定量得到快速搜尋過(guò)程的擴(kuò)散系數(shù)是8´106 bp2 s-1，這與前人的測(cè)量值是相吻合的；而慢速搜尋過(guò)程的擴(kuò)散系數(shù)是6´104 bp2 s-1。在此基礎(chǔ)上，他們利用大規(guī)模的全原子分子動(dòng)力學(xué)模擬結(jié)合馬爾可夫態(tài)模型，進(jìn)一步揭示了慢搜尋模式的工作機(jī)制，發(fā)現(xiàn)AlkD在沿著dsDNA螺旋結(jié)構(gòu)移動(dòng)一個(gè)堿基對(duì)的過(guò)程中，平動(dòng)過(guò)程和轉(zhuǎn)動(dòng)過(guò)程是依次進(jìn)行的。AlkD相對(duì)dsDNA的轉(zhuǎn)動(dòng)較慢，是一維擴(kuò)散的決速步。利用動(dòng)力學(xué)模型得到的擴(kuò)散時(shí)間尺度與實(shí)驗(yàn)測(cè)量值很好地吻合，佐證了計(jì)算模型的準(zhǔn)確性。他們還結(jié)合實(shí)驗(yàn)測(cè)量和動(dòng)力學(xué)模擬，在原子相互作用層面仔細(xì)探究了Y27位殘基對(duì)一維擴(kuò)散過(guò)程的影響機(jī)制。
圖1：融合單分子scanning FRET-FCS測(cè)量與分子動(dòng)力學(xué)模擬闡釋AlkD在dsDNA上的擴(kuò)散動(dòng)力學(xué)過(guò)程和分子機(jī)制。
文章最后提出了如圖2所示的模型：在未修飾的正常堿基區(qū)域，AlkD與dsDNA相互作用較弱，此時(shí)主要利用快速模式實(shí)現(xiàn)高效快速的搜尋；而修飾堿基會(huì)導(dǎo)致附近dsDNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的變化，從而誘導(dǎo)AlkD-dsDNA結(jié)合構(gòu)象的變化和相互作用力的加強(qiáng)，促使AlkD從快速轉(zhuǎn)變?yōu)槁偎褜つＪ?，?shí)現(xiàn)對(duì)修飾堿基的準(zhǔn)確識(shí)別。在此模型中，AlkD通過(guò)改變與dsDNA的相互作用構(gòu)象和結(jié)合強(qiáng)弱，實(shí)現(xiàn)在快慢兩種搜尋模式中的切換和調(diào)控，從而獲得靶標(biāo)搜尋中的高效和高準(zhǔn)確度。本文發(fā)展了緊密融合單分子掃描熒光共振能量轉(zhuǎn)移-相關(guān)光譜（scanning FRET-FCS）測(cè)量與馬爾可夫態(tài)模型的新型技術(shù)平臺(tái)，突破單一技術(shù)手段的局限，為揭示糖基化酶和其它DNA結(jié)合蛋白搜尋靶標(biāo)的動(dòng)態(tài)過(guò)程和分子機(jī)制提供了新的技術(shù)平臺(tái)。
圖2：AlkD找尋和識(shí)別靶標(biāo)的分子機(jī)制。
清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院陳春來(lái)研究員、香港科技大學(xué)黃旭輝教授、北京大學(xué)趙新生教授和中科院福建物質(zhì)結(jié)構(gòu)研究所張璐研究員為本文共同通訊作者。清華大學(xué)生命學(xué)院15級(jí)博士生彭思佳、香港科技大學(xué)博士生王曉維和中科院福建物質(zhì)結(jié)構(gòu)研究所張璐研究員為共同第一作者。北京大學(xué)博士生何姍珊參與了FRET-FCS實(shí)驗(yàn)。本工作獲得了國(guó)家自然科學(xué)基金委、北京結(jié)構(gòu)生物學(xué)高精尖創(chuàng)新中心、北京生物結(jié)構(gòu)前沿研究中心、清華-北大生命科學(xué)聯(lián)合中心及中國(guó)香港研究資助局的經(jīng)費(fèi)支持。
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https://doi.org/10.1073/pnas.2002971117
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