生命學(xué)院王宏偉和生物物理研究所許瑞明課題組合作在《分子細胞》發(fā)文揭示Dorsha識別pri-miRNA的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)
2020年3月27日，《分子細胞》雜志在線發(fā)表了題為“Drosha識別pri-miRNA的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)”（Structural Basis For pri-miRNA Recognition by Drosha）的研究論文，報道了中國科學(xué)院生物物理研究所許瑞明研究組和清華大學(xué)王宏偉課題組最新合作研究成果，該研究成果解析了Drosha-DGCR8復(fù)合物和pri-miRNA結(jié)合，對其進行加工的結(jié)構(gòu)。
真核細胞中存在著大量不能翻譯成蛋白質(zhì)的RNA，被稱為非編碼RNA。它們在有機體基因表達調(diào)控等諸多方面發(fā)揮重要作用，廣泛參與生長發(fā)育、組織分化等生物學(xué)過程，并且與疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。microRNA（miRNA）是一類非常重要的非編碼RNA，長度約為21~24個堿基。它們通過堿基互配與靶標mRNA相結(jié)合，從而抑制蛋白質(zhì)翻譯，或促進mRNA降解。在哺乳動物中，初始miRNA（pri-miRNA）伴隨著基因組DNA轉(zhuǎn)錄而產(chǎn)生，其長度可達數(shù)千個堿基。其核心部分為一個莖環(huán)結(jié)構(gòu)，功能miRNA包藏在該結(jié)構(gòu)的莖部雙鏈區(qū)。從pri-miRNA到成熟的功能miRNA需要依次經(jīng)歷發(fā)生在細胞核內(nèi)與胞質(zhì)中的兩步切割反應(yīng)，分別由III型RNA酶家族成員Drosha (核內(nèi))和Dicer（胞質(zhì)）催化完成。2018年，王宏偉課題組解析了Dicer復(fù)合物與底物的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)，闡明了Dicer對miRNA的識別加工機制。不同于Dicer識別底物的模式，Drosha發(fā)揮功能需要與DGCR8形成復(fù)合物（也被稱為Microprocessor復(fù)合物），其中Drosha是核心催化組分，DGCR8為雙鏈RNA結(jié)合蛋白，負責(zé)招募pri-miRNA底物。Drosha/DGCR8復(fù)合物早在2004年即被發(fā)現(xiàn)，然而一直以來，受限于難以獲得高表達及穩(wěn)定均一的重組蛋白等因素，其結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究進展緩慢。盡管前期的體外功能研究積累了大量的數(shù)據(jù)，包括鑒定了pri-miRNA上的關(guān)鍵序列、篩選了蛋白質(zhì)的功能結(jié)構(gòu)域等，但是并未解答這些序列究竟如何被識別、以及蛋白質(zhì)功能域如何參與界定pri-miRNA切割位點這些重要科學(xué)問題。
在這項研究中，研究人員成功純化、組裝了人源Drosha/DGCR8，及其結(jié)合pri-miRNA的復(fù)合物。經(jīng)過一系列條件優(yōu)化，包括交聯(lián)劑篩選、金屬離子置換以穩(wěn)定復(fù)合物結(jié)構(gòu)，經(jīng)過上千次電鏡以摸索最合適條件，最后對之進行了結(jié)構(gòu)解析。該結(jié)構(gòu)證實了Drosha在切割位點界定中的決定性作用，并首次明確了PAZ、MB helix、以及dsRBD結(jié)構(gòu)域分別對pri-miRNA的相應(yīng)區(qū)域進行識別，協(xié)同完成切割位點的定位。其中，PAZ結(jié)構(gòu)域在RNA結(jié)合前后出現(xiàn)了明顯的構(gòu)象變化，它與MB helix一起，結(jié)合在pri-miRNA的雙-單鏈交界區(qū)的兩側(cè)，形成三明治狀穩(wěn)定結(jié)構(gòu)。這個現(xiàn)象一方面從機制上闡明了pri-miRNA雙-單鏈交界區(qū)是決定切割位點的關(guān)鍵順式元件的原因，另一方面提出了PAZ結(jié)構(gòu)域識別RNA的新模式。這項工作同時還發(fā)現(xiàn)了PAZ結(jié)構(gòu)域的構(gòu)象變化反映了Drosha的不同活性狀態(tài)。在沒有pri-miRNA結(jié)合時，PAZ的發(fā)卡狀雙螺旋占據(jù)了切割活性中心區(qū)域，從而阻礙了RNA的結(jié)合；當(dāng)識別pri-miRNA底物時，該螺旋結(jié)構(gòu)向下翻轉(zhuǎn)并結(jié)合RNA，反而穩(wěn)定了與底物的相互作用。研究人員認為，這是一種從自抑制狀態(tài)到活化狀態(tài)的轉(zhuǎn)變，表明Drosha存在活性調(diào)控模式。由于體內(nèi)存在很多miRNA類似物，這種可調(diào)控模式對于底物的特異性識別具有重要意義。
Drosha通過PAZ、MB helix、dsRBD結(jié)構(gòu)域識別pri-miRNA，這些結(jié)構(gòu)域在結(jié)合底物前（左）后（右）發(fā)生構(gòu)象變化。
中國科學(xué)院生物物理研究所金文星博士，清華大學(xué)生命學(xué)院博士后王家為本文共同第一作者，清華大學(xué)生命學(xué)院王宏偉教授和中國科學(xué)院生物物理研究所所長許瑞明教授為本文共同通訊作者。本研究得到國家蛋白質(zhì)科學(xué)研究（北京）設(shè)施清華大學(xué)基地、北京市結(jié)構(gòu)生物學(xué)高精尖創(chuàng)新中心、北京市生物結(jié)構(gòu)前沿研究中心的大力支持。
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https://doi.org/10.1016/j.molcel.2020.02.024
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