最新研究成果 | 清華藥學(xué)院劉剛課題組在《ACS傳染病》發(fā)文報道新型硝基還原酶Rv2466c的熒光探針NFCs，可用于結(jié)核病的診斷和藥物敏感評
時間：2021-04-09 00:37:01學(xué)院：藥學(xué)院學(xué)校：清華大學(xué)
2019年3月27日，清華大學(xué)藥學(xué)院劉剛教授課題組及其合作者在《ACS Infectious Diseases》雜志上在線發(fā)表了題為“基于新型硝基還原酶Rv2466c的結(jié)核分枝桿菌診斷和藥敏實驗的熒光探針” (A Nitrooxidoreductase Rv2466c-dependent Fluorescent Probe for Rapid Mycobacterium Tuberculosis Diagnosis and Drug Susceptibility Testing) 的研究論文，報道了NFCs作為小分子熒光探針用于結(jié)核病診療的新發(fā)現(xiàn)。這是該課題組通過合作研究于2014年在《Journal of Medicinal Chemistry》雜志上發(fā)表關(guān)于“NFCs可以選擇性地高活性抑制復(fù)制型以及非復(fù)制型結(jié)核分枝桿菌”（doi: 10.1021/jm4019228.）以及2018年初在《ACS Infectious Diseases》雜志上發(fā)表關(guān)于“Rv2466c是結(jié)核分枝桿菌內(nèi)Mycothiol（MSH）依賴的硝基還原酶”（doi: 10.1021/acsinfecdis.7b00111）的研究結(jié)果后，在結(jié)核病診療領(lǐng)域的又一研究進展。
在全球范圍內(nèi)，結(jié)核桿菌(Mycobacterium tuberculosis, Mtb)引起的結(jié)核病(Tuberculosis, TB)是具有高致死率的傳染病之一。據(jù)WHO估計，僅2017年全球范圍內(nèi)：157萬人死于結(jié)核病，新發(fā)現(xiàn)640萬結(jié)核病案例；在新發(fā)現(xiàn)案例中有4.6%為多藥耐藥型結(jié)核桿菌 (MDR-TB) 感染，累積有105個國家發(fā)現(xiàn)有廣泛耐藥型結(jié)核桿菌(XDR-TB) 感染的病例；世界上近1/3的人口感染了潛伏性結(jié)核分枝桿菌。治療周期長，副作用大，對MDR-TB及XDR-TB不敏感是目前化學(xué)治療結(jié)核病亟待解決的問題。但是，在過去的40多年里僅有一個新結(jié)構(gòu)類型的抗結(jié)核藥物上市。除此之外，結(jié)核病的診斷方法，特別是快速診斷、耐藥診斷也長期處于緩慢的發(fā)展狀態(tài)。
2014年劉剛課題組與合作伙伴首次報道基于 (+)-Calanolide A改造的硝基呋喃香豆素類結(jié)構(gòu)（nitrofuran-coumarins，NFCs）是一種針對活動性結(jié)核和潛伏性結(jié)核分枝桿菌的高效抑制劑。(+)-Calanolide A是從馬來西亞熱帶雨林植物藤黃科胡桐屬植物長莖胡桐(Calophyllum lanigerum)中分離得到的具有抗HIV-1和抗Mtb活性的天然香豆素衍生物。在Gates基金資助下，劉剛教授團隊及其合作者通過篩選十余萬個化合物發(fā)現(xiàn)Calanolide衍生物具有較好的抗活動性結(jié)核和潛伏性結(jié)核雙重活性，并進一步細致研究了Calanolide 的構(gòu)效關(guān)系，優(yōu)化出硝基呋喃香豆素類衍生物NFCs，對活動性結(jié)核和潛伏性結(jié)核的抑制活性均可達0.08 μg/mL（圖1）。此外，相對于其他常見的革蘭氏陽性菌和陰性菌，NFCs 展示出對Mtb的選擇性抑制作用以及對感染人巨噬細胞的Mtb 的高活性（圖2）。
圖1? 天然（+）-Calanolide A及其類似物的抗結(jié)核活性研究
在全球范圍內(nèi)，結(jié)核桿菌(Mycobacterium tuberculosis, Mtb)引起的結(jié)核病(Tuberculosis, TB)是具有高致死率的傳染病之一。據(jù)WHO估計，僅2017年全球范圍內(nèi)：157萬人死于結(jié)核病，新發(fā)現(xiàn)640萬結(jié)核病案例；在新發(fā)現(xiàn)案例中有4.6%為多藥耐藥型結(jié)核桿菌 (MDR-TB) 感染，累積有105個國家發(fā)現(xiàn)有廣泛耐藥型結(jié)核桿菌(XDR-TB) 感染的病例；世界上近1/3的人口感染了潛伏性結(jié)核分枝桿菌。治療周期長，副作用大，對MDR-TB及XDR-TB不敏感是目前化學(xué)治療結(jié)核病亟待解決的問題。但是，在過去的40多年里僅有一個新結(jié)構(gòu)類型的抗結(jié)核藥物上市。除此之外，結(jié)核病的診斷方法，特別是快速診斷、耐藥診斷也長期處于緩慢的發(fā)展狀態(tài)。
2014年劉剛課題組與合作伙伴首次報道基于 (+)-Calanolide A改造的硝基呋喃香豆素類結(jié)構(gòu)（nitrofuran-coumarins，NFCs）是一種針對活動性結(jié)核和潛伏性結(jié)核分枝桿菌的高效抑制劑。(+)-Calanolide A是從馬來西亞熱帶雨林植物藤黃科胡桐屬植物長莖胡桐(Calophyllum lanigerum)中分離得到的具有抗HIV-1和抗Mtb活性的天然香豆素衍生物。在Gates基金資助下，劉剛教授團隊及其合作者通過篩選十余萬個化合物發(fā)現(xiàn)Calanolide衍生物具有較好的抗活動性結(jié)核和潛伏性結(jié)核雙重活性，并進一步細致研究了Calanolide 的構(gòu)效關(guān)系，優(yōu)化出硝基呋喃香豆素類衍生物NFCs，對活動性結(jié)核和潛伏性結(jié)核的抑制活性均可達0.08 μg/mL（圖1）。此外，相對于其他常見的革蘭氏陽性菌和陰性菌，NFCs 展示出對Mtb的選擇性抑制作用以及對感染人巨噬細胞的Mtb 的高活性（圖2）。
圖1? 天然（+）-Calanolide A及其類似物的抗結(jié)核活性研究
圖2? NFCs可選擇性抑制Mtb并感染人巨噬細胞的Mtb
該類化合物具有遺傳毒性導(dǎo)致無法繼續(xù)開發(fā)新藥，但其新穎的作用機制引起了研究團隊的興趣。通過遺傳學(xué)，結(jié)構(gòu)生物學(xué)，計算化學(xué)，生物化學(xué)和生物物理學(xué)等手段及方法揭示了與NFCs活性相關(guān)的酶—Rv2466c，為一類新型的氧化應(yīng)激硝基還原酶。該酶需在小分子硫醇mycothiol（MSH）輔助下，將NFCs的硝基還原為氨基（圖3），并產(chǎn)生抑菌作用。Rv2466c、MSH、NFCs三者存在怎樣的相互作用以及酶具體的還原機制是什么？該研究在結(jié)核病的診療過程中是否存在臨床應(yīng)用意義？劉剛教授團隊為此進行了進一步研究。實驗結(jié)果可以推測，Mtb分泌的小分子硫醇MSH通過其乙?；腚装彼崛〈钠咸烟前凡糠郑╝cetylated cysteine-glucosamine，AcCys-GlcN）結(jié)合Rv2466c，隨后其巰基與與蛋白Cys 19形成二硫鍵（mycothiolation）后，調(diào)節(jié)蛋白形成活性構(gòu)象，從而允許NFCs的進入，并與蛋白的W21，N51和Y61的相互作用形成Rv2466c/MSH/NFCs（RvMN）三元復(fù)合物；隨后，Rv2466c還原NFCs的硝基為氨基（圖3），這個過程伴隨著熒光的釋放，可用于Mtb的快速診斷及藥敏實驗。隨后的臨床轉(zhuǎn)化實驗證明：（1）NFC熒光檢測技術(shù)用于臨床痰樣本的診斷，與對照方法MGIT 960相比具有較高的一致性（曲線下面積：0.956，敏感性：87.8%，特異性：99.0%，閾值：1.559；（2）NFC熒光檢測技術(shù)用于Mtb臨床分離菌株的藥敏實驗，與臨床微孔板藥敏檢測法及微孔阿爾瑪藍檢測法（microplate-based alamarBlue assay，MABA）對比一致性高；（3）NFC熒光檢測技術(shù)可直接用于臨床隨機痰樣本的藥敏試驗，可給出準確的MIC值。
綜上，NFC技術(shù)是一種基于結(jié)核分枝桿菌內(nèi)硝基氧化還原酶Rv2466c的熒光診斷探針分子，具有機制新穎、操作簡便、成本低廉、高通量以及可獲得準確MIC值等優(yōu)點，有望成為一種新型、簡便、經(jīng)濟、準確的結(jié)核病診斷以及耐藥結(jié)核病篩選方法，有利于結(jié)核的個體化治療。
圖3? Rv2466c依賴于MSH還原NFCs并釋放熒光物質(zhì)，可用于結(jié)核病的診斷和藥物敏感性評價
總的來說，劉剛團隊及其合作者的這三項研究成果，講述了NFC類分子，從“具有抗結(jié)核活性”、到“治療結(jié)核“再到“診斷結(jié)核“這一艱難而又精彩的“分子歷程”。
清華大學(xué)藥學(xué)院劉剛教授是本文的核心通訊作者。此外，首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京胸科醫(yī)院的孫照剛研究員合作研究討論、臨床實驗的設(shè)計，為文章的共同通訊作者。劉剛課題組博士生穆然、孫照剛課題組碩士生孔成成、劉剛課題組博士生于文俊及博后王洪耀為論文的共同第一作者。清華大學(xué)醫(yī)學(xué)院李海濤教授、美國康奈爾醫(yī)學(xué)院Selin Somersan-Karakaya博士也參與了討論，并給與了幫助。該研究得到了自然科學(xué)基金委、北京結(jié)構(gòu)生物學(xué)高精尖創(chuàng)新中心、以及北京科技委員會基金的支持和幫助。
原文鏈接：https://pubs.acs.org.ccindex.cn/doi/10.1021/acsinfecdis.9b00006
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