上海交大吳強課題組致遠榮譽計劃2019級博士生石欣發(fā)現(xiàn)基因編輯新切割方式
?????? 2019年10月1 日，上海交通大學系統(tǒng)生物醫(yī)學研究院比較生物醫(yī)學中心吳強課題組在基因編輯領域又取得新進展，國際著名OA學術期刊《細胞發(fā)現(xiàn)》發(fā)表了題為“Cas9 has no exonuclease activity resulting in staggered cleavage with overhangs and predictable di- and tri-nucleotide CRISPR insertions without template donor”的最新研究成果。該研究發(fā)現(xiàn)了SpCas9新的切割方式，并首次提出SpCas9沒有外切酶活性。
?????? 基因編輯在生物醫(yī)藥和生命信息等領域中一直扮演著重要的角色，但傳統(tǒng)的基因編輯技術由于構造困難因此在一定程度上阻礙了它的發(fā)展，而CRISPR/Cas9技術的問世則很好的克服了這一缺點。CRISPR/Cas9系統(tǒng)是細菌和古生菌的一種天然免疫系統(tǒng)。當外源核酸入侵時，Cas9蛋白就會在RNA的介導下定向切割核酸，發(fā)揮免疫功能。經(jīng)過改造后的第三代基因編輯工具CRISPR/Cas9因其簡單，高效，低廉等優(yōu)點為廣大科研工作者所利用。但即便如此，人們對Cas9蛋白的切割機制和切割后的修復機制還知之甚少。
?????? 在以往的研究中，以CRISPR/Cas9領域的權威杜德娜（Doudna）和夏龐蒂埃（Charpentier）為代表的科學家們普遍認為Cas9只能在PAM位點上游3堿基處切割DNA雙鏈產(chǎn)生平末端，并把在體外切割實驗中觀察到的長短不一的切割產(chǎn)物解釋為Cas9的核酸外切酶活性。但近年來隨著研究的深入，越來越多的證據(jù)表明Cas9蛋白存在切割產(chǎn)生粘性末端的活性。這一顛覆性成果由吳強課題組首先取得，相關文章于2018年8月正式發(fā)表在國際權威期刊Molecular Cell《分子細胞》上，該文章第一次明確提出Cas9存在在非互補鏈PAM位點上游4堿基處切割產(chǎn)生粘性末端的活性，顛覆了傳統(tǒng)的認知。
?????? 雖然Cas9在PAM位點上游4堿基處切割產(chǎn)生粘性末端的活性已經(jīng)得到了承認，但對于Cas9是否存在其他的切割活性仍然存在爭議。圍繞這一問題，吳強課題組致遠榮譽計劃2019級博士生石欣和博士后壽佳利用一對sgRNA對DNA片段進行編輯，并對重排接口進行了高通量測序分析。結果表明不僅單堿基的插入存在著規(guī)律，兩堿基甚至三堿基的插入也同樣存在著相似的規(guī)律且這種插入可以精準預測：它們由PAM位點上游-4，-5，-6位堿基所決定。這種規(guī)律性的兩堿基，三堿基的插入暗示SpCas9存在著PAM位點上游-5，-6位切割的活性，這種新的發(fā)現(xiàn)作為一種補充，不僅擴大了人們對于SpCas9切割活性的認知，還從另一側面驗證了Cas9的在PAM位點上游4堿基處切割的活性。至此，吳強課題組修改了現(xiàn)有的模型，并提出了新的切割連接模型。
?????? 為了進一步直觀地驗證這種新的切割活性，石欣和壽佳還進行了體外切割實驗并對切割產(chǎn)物進行了高通量測序分析，結果表明對于非互補鏈，Cas9切割后產(chǎn)生了不同長度的突出末端的切割產(chǎn)物，即產(chǎn)生了一個堿基，兩個堿基，三個堿基的5’突出末端。而對于互補鏈，切割產(chǎn)物長度一致。這一體外實驗不僅更直觀地表明Cas9在非互補鏈PAM位點上游-4，-5，-6位的切割活性，還對互補鏈的切割只發(fā)生在PAM位點上游3堿基處進行了驗證。值得注意的是，該研究第一次在體外切割實驗中直觀地證實了Cas9的產(chǎn)生粘性末端的切割活性。
?????? 總之，該研究首次證明了Cas9在非互補鏈PAM位點上游-5，-6的切割活性，并否定了此前認為的不同長度的切割產(chǎn)物是由于Cas9存在外切酶活性所致這一假設。不僅如此，該項研究還為精確可控的兩堿基、三堿基的基因編輯奠定了基礎，并為人類遺傳疾病的治療提供了潛在的方向。在基因編輯如火如荼的今天，使用單個sgRNA切割造成基因失活早就成為常態(tài)，但利用一對sgRNA對DNA大片段進行編輯，并將其用于基因組元件及染色質(zhì)三維結構方面的研究還并未成熟?？梢灶A見，該研究不僅為基礎研究發(fā)揮重大作用，同時還有望推動精確基因編輯及細胞修復機制的進一步深入理解。
?????? 吳強課題組長期致力于基因編輯技術的研究，尤其關注于DNA大片段編輯。在2015年，課題組博士李金環(huán)和壽佳就在《分子細胞生物學》雜志發(fā)表了關于DNA大片段編輯的一系列系統(tǒng)性的工作。通過一對sgRNA的使用，產(chǎn)生的兩個四個斷裂末端連接后會產(chǎn)生包括DNA片段刪除，反轉，重復，易位等重排結果。課題組開發(fā)的DNA大片段編輯技術不僅方便了基因組元件功能的研究，還為疾病模型的建立提供便利。同年，吳強課題組利用DNA大片段編輯技術研究了CTCF蛋白的結合位點的方向性與染色體高級結構之間的關系，通過對CTCF結合位點的反轉，結合計算生物學揭示了CTCF蛋白結合位點的方向性在染色質(zhì)高級結構中的重要規(guī)律，相關結果發(fā)表在國際頂級期刊Cell《細胞》上。不僅如此，課題組還利用DNA大片段編輯技術對原鈣粘蛋白腦發(fā)育功能進行了研究，相關進展于2018年6月發(fā)表在eLife上。
?????? 上海交通大學吳強為通訊作者，交大致遠榮譽計劃2019級博士生石欣和博士后壽佳為共同第一作者，石欣同學今年6月以優(yōu)異成績畢業(yè)于南開大學，于九月正式到上海交大報到。該研究得到國家自然科學基金委員會和科技部的資助。
版權與免責聲明：本網(wǎng)頁的內(nèi)容由收集互聯(lián)網(wǎng)上公開發(fā)布的信息整理獲得。目的在于傳遞信息及分享，并不意味著贊同其觀點或證實其真實性，也不構成其他建議。僅提供交流平臺，不為其版權負責。如涉及侵權，請聯(lián)系我們及時修改或刪除。郵箱：sales@allpeptide.com