?????? 2018年3月27日，《EBioMedicine》雜志（《EbioMedicine》是由臨床四大期刊之一的《The Lancet》和CNS 期刊《Cell》 聯(lián)合支持的開源期刊，旨在促進(jìn)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)向臨床醫(yī)學(xué)的轉(zhuǎn)化。）在線發(fā)表了上海交通大學(xué)系統(tǒng)生物醫(yī)學(xué)研究院陶生策團(tuán)隊(duì)關(guān)于結(jié)核?。═uberculosis，TB）治療新靶點(diǎn)的研究論文，該研究發(fā)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，Mtb）類泛素連接酶PafA的絲氨酸119位可作為一個(gè)非常高效和特異的靶點(diǎn)用于新型抗結(jié)核藥物的篩選和設(shè)計(jì)。
?????? 世界衛(wèi)生組織（WHO）2017全球結(jié)核病報(bào)告顯示：2016年有超過170萬(wàn)人死于結(jié)核病，在眾多感染性疾病中，結(jié)核病已成為全球頭號(hào)殺手。而目前的現(xiàn)實(shí)是 Mtb 的耐藥性日益增加，同時(shí)極度缺乏新的抗結(jié)核藥物，使得多耐藥 （Multi Drug Resistance， MDR），廣泛耐藥 （Extensive Drug Resistance，XDR） 結(jié)核病病人幾乎無(wú)藥可治。MDR和XDR所針對(duì)的是傳統(tǒng)的抗結(jié)核藥物和傳統(tǒng)的藥物靶點(diǎn)，因此，尋找新的高效抗 Mtb 藥物靶點(diǎn)迫在眉睫。
?????? 類泛素-蛋白酶體系統(tǒng)（Pup-Proteasome system，PPS）是Mtb體內(nèi)一種類似于真核生物泛素-蛋白酶體系統(tǒng)（Ubiquitin-Proteasome system，UPS）的蛋白質(zhì)選擇性降解，已被證明對(duì)Mtb在宿主體內(nèi)的生存至關(guān)重要。在該通路中，PafA作為目前已知的唯一類泛素連接酶，催化類泛素Pup與底物之間的連接反應(yīng)。序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)PafA在人體里面沒有同源蛋白，并且PPS途徑在絕大多數(shù)腸道微生物里面亦不存在。結(jié)合這些特征，我們認(rèn)為PafA是一個(gè)極具潛力的結(jié)核病藥物靶點(diǎn)。然而Mtb PafA的提純和活性保持困難，蛋白結(jié)構(gòu)尚未被解析，針對(duì)其開發(fā)抑制劑不易，無(wú)相關(guān)抑制劑或抑制機(jī)制報(bào)道。
?????? 在本項(xiàng)工作中，研究人員發(fā)現(xiàn)PafA的類泛素連接酶活性在可被絲氨酸蛋白酶抑制劑AEBSF高效抑制。質(zhì)譜分析表明AEBSF主要通過共價(jià)結(jié)合絲氨酸119位點(diǎn)發(fā)揮抑制作用。進(jìn)一步，通過模擬AEBSF結(jié)合的空間位阻影響，將絲氨酸119位點(diǎn)突變?yōu)楸江h(huán)家族的氨基酸后PafA幾乎完全喪失了類泛素連接酶活性。序列分析發(fā)現(xiàn)S119所在區(qū)域高度保守，因此研究人員利用目前已有的谷氨酸棒狀桿菌PafA（PafACglu）的結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。研究發(fā)現(xiàn)S126（S119的同源位點(diǎn)）臨近于PafA結(jié)合Pup C-末端的凹槽處。分子動(dòng)力學(xué)模擬結(jié)果顯示對(duì)S119進(jìn)行擾動(dòng)，如結(jié)合AEBSF或突變?yōu)楸奖彼峥稍斐蒔up的C-末端和PafA的結(jié)合力減弱，從而抑制了類泛素連接酶活。隨后利用生物膜層干涉技術(shù)（BLI）和賴氨酸類泛素連接實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了這一發(fā)現(xiàn)。最后，研究人員在氮饑餓培養(yǎng)基和巨噬細(xì)胞中探索了針對(duì)S119位點(diǎn)的擾動(dòng)對(duì)分枝桿菌的生存影響。結(jié)果顯示針對(duì)S119位點(diǎn)的擾動(dòng)可以抑制分枝桿菌在上述條件下的生存。
?????? 綜上所述，該研究通過多角度證明了PafA S119位點(diǎn)可作為一個(gè)全新的“精確”抗結(jié)核靶點(diǎn)用于抗結(jié)核藥物的篩選和設(shè)計(jì)。考慮到針對(duì)Mtb PafA設(shè)計(jì)抑制劑存在的諸多困難，該研究可為開發(fā)特異性靶向Mtb PafA的抑制劑提供清晰的方向，為最終攻克耐藥性結(jié)核病提供可能的選項(xiàng)。在本研究的基礎(chǔ)上，陶生策團(tuán)隊(duì)已同多方合作在積極開展針對(duì)PafA S119的抗結(jié)核藥物開發(fā)，獲得了一批有潛力的新化合物，后續(xù)工作在穩(wěn)步推進(jìn)中。
?????? 上海交通大學(xué)系統(tǒng)生物醫(yī)學(xué)研究院陶生策研究員為本文通訊作者。博士生江何偉為第一作者。陶生策研究員的主要研究方向?yàn)榈鞍踪|(zhì)芯片技術(shù)的開發(fā)和應(yīng)用以及結(jié)核病系統(tǒng)生物學(xué)研究。建立了系列特色蛋白質(zhì)芯片技術(shù)平臺(tái)，并在其基礎(chǔ)上開展了與醫(yī)學(xué)密切相關(guān)的系統(tǒng)性研究。
?????? 本研究得到了十三五蛋白質(zhì)機(jī)器與生命過程調(diào)控重點(diǎn)專項(xiàng)、國(guó)家“十二五”傳染病重大專項(xiàng)以及國(guó)家自然科學(xué)基金等資助。
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英文摘要：
Identification of Serine 119 as an effective inhibitor binding site of M. tuberculosis ubiquitin-like protein ligase PafA using purified proteins and M. smegmatis
Owing to the spread of multidrug resistance (MDR) and extensive drug resistance (XDR), there is a pressing need to identify potential targets for the development of more-effective anti-M. tuberculosis (Mtb) drugs. PafA, as the sole Prokaryotic Ubiquitin-like Protein ligase in the Pup-proteasome System (PPS) of Mtb, is an attractive drug target. Here, we show that the activity of purified Mtb PafA is significantly inhibited upon the association of AEBSF (4-(2-aminoethyl) benzenesulfonyl fluoride) to PafA residue Serine 119 (S119). Mutation of S119 to amino acids that resemble AEBSF has similar inhibitory effects on the activity of purified Mtb PafA. Structural analysis reveals that although S119 is distant from the PafA catalytic site, it is located at a critical position in the groove where PafA binds the C-terminal region of Pup. Phenotypic studies demonstrate that S119 plays critical roles in the function of Mtb PafA when tested in M. smegmatis. Our study suggests that targeting S119 is a promising direction for developing an inhibitor of M. tuberculosis PafA.
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http://www.ebiomedicine.com/article/S2352-3964(18)30112-9/fulltext
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