吳起課題組：【酶催化】光脫羧酶催化外消旋羧酸的選擇性脫羧反應
帶有α-官能團的手性羧酸是很多藥物和天然產(chǎn)物的重要中間體或者結(jié)構(gòu)砌塊。目前已經(jīng)有很多制備含α-官能團的手性羧酸的合成方法。通常的化學合成法需要用到過渡金屬催化劑和復雜的手性配體。與化學法相比，生物催化可以以更加綠色和可持續(xù)的方式制備這一類重要的手性化合物。例如酮還原酶和亞胺還原酶都已經(jīng)成功地用于從α-酮酸到α-羥基/氨基酸的轉(zhuǎn)化，此外水解酶催化的酯或者酸的動力學拆分也是廣泛使用的方法。然而這些生物催化方法通常需要輔因子的參與或者將酸提前制備為相應的酯或酰胺化合物。因而探索更加簡單高效且不需輔因子的新型生物催化方法制備含α-官能團的手性羧酸顯得極為重要。
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化學系的吳起課題組最近報道了一種利用光脫羧酶來高效拆分含α-官能團的外消旋羧酸的新方法。他們選擇了一種來源于小球藻（Chlorella variabilis）NC64A的脂肪酸光脫羧酶（CvFAP）作為催化劑，以2-羥基辛酸的脫羧反應為模型開展研究。CvFAP可將不同鏈長（C12-C22）的脂肪酸在無任何輔助因子的作用下脫羧生成相應的烷烴或者烯烴。他們設(shè)想CvFAP的催化空腔可能對外消旋酸具有立體選擇性，從而可以利用脫羧反應來實現(xiàn)外消旋羧酸的手性拆分。然而，研究發(fā)現(xiàn)野生型CvFAP的催化活性較差，12小時光照反應后只有20%的底物轉(zhuǎn)化率，底物的對映體過量值（ee）只有22%。為了解決該問題，他們對CvFAP進行了蛋白質(zhì)工程化改造。
圖1. 基于CvFAP酶進行含α-官能團的羧酸的光驅(qū)動動力學拆分。圖片來源：Angew. Chem. Int. Ed.
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定向進化中無論是隨機突變還是飽和突變，突變株篩選的工作量都非常龐大。因此，他們在文章中采用了基于“大氨基酸掃描”策略的理性設(shè)計方法，結(jié)合CvFAP酶的晶體結(jié)構(gòu)，選擇了A384、L386和G462三個位點，將原有位點的氨基酸通過定點突變替換為包括Q、K、F和Y在內(nèi)的大體積氨基酸。篩選結(jié)果發(fā)現(xiàn)突變株G462Y最好，可以在51%的轉(zhuǎn)化率下獲得99%ee值的R-構(gòu)型底物。動力學測試結(jié)果表明G462Y突變株的活性相比野生型提高了30倍。進一步研究發(fā)現(xiàn)G462Y突變株具有較廣泛的底物譜，一系列具有C6-C12不同鏈長或者具有不同取代基的α-羥基酸、以及α-氨基酸都能獲得良好的手性拆分結(jié)果。分子動力學模擬發(fā)現(xiàn)在C462Y突變株中，活性位點周圍的一些氨基酸有助于穩(wěn)定R-構(gòu)型底物，阻止它靠近FAD輔因子；而S-構(gòu)型底物則與FAD中的N5原子具有更小的距離，從而使得S-構(gòu)型羧酸底物更容易發(fā)生脫羧反應。
表1. 在選擇位點引入大體積氨基酸（Q、K、F和Y）的效果評估。圖片來源：Angew. Chem. Int. Ed.
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圖2. 野生型CvFAP和C462Y突變體的光驅(qū)動動力學拆分的底物范圍。圖片來源：Angew. Chem. Int. Ed.
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該研究第一次實現(xiàn)了光脫羧酶CvFAP的立體選擇性脫羧反應，為手性羧酸的合成提供了一種新的方法，有望在制藥、綠色有機合成等領(lǐng)域中獲得重要的應用。
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這一成果近日發(fā)表在Angew. Chem. Int. Ed.上。該文章的第一作者是化學系的博士生徐鑒，通訊作者為吳起副教授。
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Light?Driven Kinetic Resolution of α?Functionalized Carboxylic Acids Enabled by an Engineered Fatty Acid Photodecarboxylase
Jian Xu, Yujing Hu, Jiajie Fan, Mamatjan Arkin, Danyang Li, Yongzhen Peng, Weihua Xu, Xianfu Lin, Qi Wu
Angew. Chem. Int. Ed.,?2019,?58, 8474-8478, DOI: 10.1002/anie.201903165
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科研思路分析
Q：這項研究最初是什么目的？或者說想法是怎么產(chǎn)生的？
A：我們課題組的研究興趣是探索各種酶催化的新功能，以實現(xiàn)生物催化在有機合成領(lǐng)域中更廣泛的應用。光脫羧酶CvFAP是法國Beisson教授和合作者于2017年最早發(fā)現(xiàn)并報道的一個能利用光能的酶（Science,?2017,?357, 903?907）。該酶催化的天然底物都是一些長鏈的脂肪酸，產(chǎn)物是一些沒有手性中心的烷烴或者烯烴。酶作為一類具有高度立體選擇性的催化劑，其手性空腔可以通過定向進化等蛋白質(zhì)工程手段進行調(diào)節(jié)。因此，我們設(shè)想CvFAP脫羧酶的催化中心也應該是具有立體選擇性的特質(zhì)，如果底物是外消旋羧酸的話，很可能會導致兩種構(gòu)型羧酸的脫羧反應的活性區(qū)別，從而實現(xiàn)羧酸的高效拆分。而這樣的酶催化拆分反應是從來沒有報道過的。
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Q：研究過程中遇到哪些挑戰(zhàn)？
A：正如文中所述，野生型CvFAP對這些外消旋羧酸的反應活性很弱，雖然對于某些底物野生型CvFAP也體現(xiàn)出了較高的立體選擇性，但是由于產(chǎn)物是沒有手性的，因此難以獲得高光學純度的α-取代羧酸化合物。因此，本項研究中最大的挑戰(zhàn)是如何提高CvFAP酶的催化活性。雖然酶的定向進化研究已經(jīng)有了很多的報道，但是我們團隊在酶蛋白質(zhì)工程的理性設(shè)計方面的經(jīng)驗積累起了至關(guān)重要的作用（J. Am. Chem. Soc.,?2019,141(19): 7934-7945;?Chem. Commun.,?2019,?55, 2198-2201;?Adv. Synth. Catal.,2019,?361, 126-134;?ACS Catal.,?2017,?7, 4542?4549），可以讓我們在少量突變株篩選的基礎(chǔ)上就可以獲得我們所需要的目標突變株。
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Q：該研究成果可能有哪些重要的應用？哪些領(lǐng)域的企業(yè)或研究機構(gòu)可能從該成果中獲得幫助？
A：帶有α-官能團的手性羧酸是很多藥物和天然產(chǎn)物的重要中間體或者結(jié)構(gòu)砌塊。正如文中所述，我們發(fā)展的光脫羧酶催化外消旋羧酸的立體選擇性拆分方法，和以前所報道的化學法、酶還原法或者水解酶催化拆分方法相比，具有一些獨特的優(yōu)勢，例如光引發(fā)、不需要輔酶循環(huán)、以及酸底物的衍生化等。我們相信這項研究為手性羧酸的合成提供了一種新的方法，有望在制藥、綠色有機合成等領(lǐng)域中獲得重要的應用。
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?來源：X-MOL微信公眾號
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