轉載《中國科學報》報道：低光毒探針“點亮”線粒體閱讀次數(shù)：
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? 北大團隊利用新發(fā)明的低光毒性PKM系列探針處理細胞，在自主研發(fā)的Hessian-SIM儀器上進行線粒體成像實驗。北京大學分子醫(yī)學研究所供圖 ?■本報記者 倪偉波 唐琳 近日，《化學科學》以在線形式發(fā)表的一項研究成果顯示，來自北京大學和西湖大學的研究人員合作研發(fā)出兩款新型探針——PK Mito Red（PKMR）和 PK Mito Deep Red（PKMDR），首次在活細胞水平上實現(xiàn)了光毒性的明顯降低。 21世紀被認為是生命科學的時代。科學家為了進一步揭開細胞生物學過程的神秘面紗，研發(fā)了各種各樣的生物成像技術。其中，熒光超分辨率成像因簡單的成像條件及對生物樣品的相容性脫穎而出。 不過，熒光超分辨率成像往往需要更多的光子，因為活細胞超分辨率成像需要熒光探針在漂白之前發(fā)出更多光子?？茖W家除了聚焦在如何改善熒光探針光穩(wěn)定性，更關注漂白過程產(chǎn)生的光毒性。 突破超分辨成像“卡脖子”問題 早在2018年，北京大學分子醫(yī)學研究所陳良怡團隊研發(fā)的海森結構光顯微鏡（Hessian SIM），首次揭示了活細胞中線粒體的精細內(nèi)嵴結構及其動態(tài)變化。為了滿足新型光學顯微鏡的需求，國內(nèi)外諸多科研團隊發(fā)展了多種光穩(wěn)定性的新型線粒體探針，用于觀察線粒體內(nèi)嵴結構。 然而，超分辨率成像需要的高激發(fā)光強往往使線粒體熒光探針更易產(chǎn)生活性氧物種（ROS），且不隨采樣時間的間隔增加而消失。這樣的超分辨率成像，即便熒光探針本身并未被完全漂白，也將迅速破壞線粒體內(nèi)嵴，使線粒體腫脹、變圓。 “光毒性雖然對光學分辨率沒有影響，但是會對細胞結構產(chǎn)生極大影響，細胞會受傷害甚至死亡，這種情況下看到的東西與生理反應完全不同。”此項工作的通訊作者之一、北京大學分子醫(yī)學研究所研究員陳知行告訴《中國科學報》。 換句話說，活細胞超分辨率成像需要解決的主要問題實際上是改善光毒性，而不僅僅是光漂白。 針對這一領域的新痛點，陳知行團隊利用分子內(nèi)綴合環(huán)辛四烯的策略，成功合成了兩種新型低光毒性線粒體熒光探針——PKMR和PKMDR，首次在活細胞水平上實現(xiàn)了光毒性的明顯降低。 不僅如此，陳知行團隊通過與陳良怡團隊、西湖大學雷凱團隊合作，通過更進一步的實驗，證明新染料對細胞的光毒性顯著低于MitoTracker系列商業(yè)染料，可實現(xiàn)1000幀以上、線粒體內(nèi)嵴形狀基本不變的超分辨成像；首次證明該探針可以用于渦蟲的干細胞流式分選，且不影響干細胞的多能性，可以真正用于研究如干細胞重編程等生理過程中的線粒體功能。 低光毒 更溫柔 陳知行介紹，熒光探針的光毒性一般來自于激發(fā)過程中由第一激發(fā)單重態(tài)（S1）經(jīng)過系間竄躍產(chǎn)生的第一激發(fā)三重態(tài)（T1），T1態(tài)與氧氣作用可產(chǎn)生單線態(tài)氧等活性氧物種，進而破壞生物分子。 為了最大程度抑制這一過程從而減少光毒性，團隊采用了之前應用于染料激光、單分子成像等領域減少光漂白的分子內(nèi)綴合三線態(tài)淬滅劑（自修復染料 Self-Healing Dye）的策略。HeLa細胞的光照存活實驗發(fā)現(xiàn)，常見三線態(tài)淬滅基團中只有環(huán)辛四烯（COT）能有效降低熒光成像中的光毒性。更為重要的是，團隊還觀察到，能夠降低光漂白的基團（硝基苯）并不一定能減少光毒性。 正因為如此，“熒光探針的光毒性和光漂白性質(zhì)應該被分別測試，但以往的熒光探針設計中往往忽視了對探針光毒性等性質(zhì)的詳細表征”。陳知行解釋道。 在此基礎上，團隊以COT作為三線態(tài)淬滅基團，合成了兩種以Cyanine為母核的熒光探針PKMR和PKMDR。HeLa細胞的光照存活實驗表明，新探針的光毒性不及對應光譜的商業(yè)探針（MitoTrackers）的1/5，并能在相同條件下提供同樣甚至更高的亮度。 “可以說，此項工作為該領域找到了新方向，未來希望能將探針的光毒性降到更低，甚至徹底消除?！标愔斜硎?。 協(xié)同創(chuàng)新 邁向極致 2018年6月，回國后的陳知行加入到北京大學分子醫(yī)學研究所。彼時，陳良怡團隊研發(fā)的Hessian SIM不僅將光學顯微鏡的性能提升到一個全新的高度，還從數(shù)學和物理兩方面大大改善了超分辨成像技術的光毒性。 要將超分辨成像技術做到極致，必須從化學探針方向進行協(xié)同創(chuàng)新。而化學研究出身的陳知行的加入，無疑為團隊注入了一股強勁的動力。 從2018年6月開始進行探針研究，到如今取得重要突破，團隊只用了1年多的時間，卻迭代了3代設計，最終找到了有效方案。 長期從事渦蟲干細胞再生研究的雷凱團隊在測試了新探針在渦蟲干細胞分選領域的應用后，發(fā)現(xiàn)新探針標記線粒體可以幫助分選出干細胞群，而且新探針標記的干細胞在體外仍能維持較好的活性和干性，充分展示了其在流式熒光分析分選中優(yōu)秀的生物相容性。 更難能可貴的是，新探針在長時程超分辨成像方面也顯示出卓越的優(yōu)勢。Hessian SIM成像結果顯示，新探針在提供了接近2D Hessian SIM理論值的分辨率、展示了清晰線粒體嵴結構圖像的同時，最大程度保留了線粒體健康的原始形態(tài)。而使用商業(yè)染料MitoTracker Red CMXRos （MTR）標記的線粒體在140幀左右就發(fā)生了腫脹和明顯形變，200幀以上已不可見嵴等正常生理結構，而PKMR標記的線粒體可以提供1000幀以上的健康線粒體圖像，2000幀左右線粒體的形變程度仍小于商業(yè)探針的200幀。 “下一步，我們將繼續(xù)在數(shù)學、物理、化學三方面協(xié)同推進，把技術推到極致。同時，爭取將來發(fā)力轉化，打破外國公司在高端成像儀器/探針方向的壟斷，真正實現(xiàn)為生物醫(yī)學研究者提供超越國外產(chǎn)品的國產(chǎn)高端成像工具。”陳知行表示。 相關論文信息：https://doi.org/10.1039/D0SC02837A 《中國科學報》 (2020-09-07 第3版 醫(yī)藥健康) |
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注：轉載自http://news.sciencenet.cn/sbhtmlnews/2020/9/357545.shtm
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