朱志偉教授團(tuán)隊(duì)在羧酸還原酶改造與設(shè)計(jì)方面取得新進(jìn)展
脂肪酸是生物體內(nèi)合成的單元羧酸，其甘油三酯衍生物（俗稱油或脂肪）是重要的生產(chǎn)和生活資料，除我們熟知的食用油外，甘油三酯也是食品、飼料、生物柴油和油脂化工等行業(yè)的重要原料。其中油脂化工的主要任務(wù)是對(duì)脂肪酸進(jìn)行衍生化，所生產(chǎn)的許多油脂化學(xué)品可代替石化產(chǎn)品，且品質(zhì)精良，并廣泛用于家用化學(xué)品、個(gè)人護(hù)理、藥物、橡膠、塑料，油漆和潤(rùn)滑劑等。
還原脂肪酸為脂肪醇是高值化脂肪酸最重要的衍生反應(yīng)之一，但由于羧基的化學(xué)惰性，脂肪酸需預(yù)先激活形成硫脂衍生物才能進(jìn)行生物還原。典型的脂肪酸硫脂衍生物包括酰基輔酶A（Acyl-CoA）和?；??；d體蛋白（Acyl-ACP），可通過還原酶催化形成脂肪醛和脂肪醇。而羧酸還原酶（Carboxylicacidreductase, CAR）是一類特殊的多功能酶，可直接利用脂肪酸為底物，其腺苷化結(jié)構(gòu)域（Adenylationdomain,Adomain）催化羧酸底物與ATP反應(yīng)生成?；?AMP中間體，并將?；D(zhuǎn)移到肽基載體蛋白（Peptidyl carrier protein, PCP）形成共價(jià)?；?PCP硫酯中間體，該中間體再經(jīng)還原酶結(jié)構(gòu)域（Reductasedomain，Rdomain）催化還原為脂肪醛。由于羧酸還原酶獨(dú)有的特性，在脂肪酸衍生物微生物合成領(lǐng)域有重要的應(yīng)用前景。
在前期再造酵母細(xì)胞工廠合成中鏈脂肪酸的基礎(chǔ)上（Zhu et al. Nature Chemical Biology 2017, 13:360-362;Zhu et al. Nature Catalysis 2020, 3:64-74），針對(duì)羧酸還原酶底物特異性差的缺點(diǎn)，為提升該酶選擇性還原中鏈脂肪酸的能力，本研究組合多種蛋白質(zhì)工程手段對(duì)羧酸還原酶進(jìn)行了改造和設(shè)計(jì)。包括（1）非理性定向進(jìn)化，利用羧酸還原酶有利于緩解中鏈脂肪酸細(xì)胞毒性這一特點(diǎn)，設(shè)計(jì)與生長(zhǎng)偶聯(lián)的富集手段，對(duì)該酶的隨機(jī)突變文庫(kù)進(jìn)行篩選，可獲得更好突變體；（2）理性定點(diǎn)突變，通過比較不同酶腺苷化結(jié)構(gòu)域的底物口袋，找到了控制底物鏈長(zhǎng)的特定氨基酸殘基I303，突變?cè)摪被釣榇髠?cè)鏈色氨酸，可使酶的底物口袋變小，催化中鏈脂肪酸的活性增加；（3）半理性設(shè)計(jì)，針對(duì)還原酶結(jié)構(gòu)域中由三個(gè)氨基酸殘基（C983–M985）組成的開關(guān)序列，采用定點(diǎn)飽和突變加富集篩選，也可獲得活性提高的突變體；（4）結(jié)構(gòu)域替換和增添，針對(duì)羧酸還原酶只能特異性催化2e-還原，替換原有還原酶結(jié)構(gòu)域?yàn)榭纱呋?e-還原的異源還原酶結(jié)構(gòu)域，沒有取得理想效果，然而增添一套4e-還原的異源還原酶結(jié)構(gòu)域，也可使脂肪醇合成能力提升；（5）部分突變位點(diǎn)的組合，顯示出協(xié)同和疊加效果。本研究設(shè)計(jì)和改造羧酸還原酶，使其催化轉(zhuǎn)化中鏈脂肪酸的能力顯著提升，為利用該酶合成中鏈脂肪醇及其衍生物提供了基礎(chǔ)。
該研究由我院朱志偉教授與瑞典查爾姆斯理工大學(xué)Jens Nielsen教授（中國(guó)工程院外籍院士）、奧地利格拉茨理工大學(xué)MargitWinkler博士等合作完成。朱志偉教授在項(xiàng)目提出、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、數(shù)據(jù)獲取與分析、項(xiàng)目合作協(xié)調(diào)等方面均有重要貢獻(xiàn)。相關(guān)論文近日發(fā)表在權(quán)威綜合類雜志《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊》（Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, PNAS），瑞典查爾姆斯理工大學(xué)胡雅婷博士和朱志偉教授為論文的共同第一作者。
全文鏈接：
Hu Y, Zhu Z, Gradischnig D, Winkler M, Nielsen J, Siewers V: Engineering carboxylic acid reductase for selective synthesis of medium-chain fatty alcohols in yeast. Proc Natl AcadSci USA 2020:202010521.
https://www.pnas.org/content/117/37/22974.short
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