Cell | 白凡課題組與合作團(tuán)隊揭示兒童結(jié)腸炎及炎癥性腸病的致病機(jī)制及治療方法
2019年11月14日，北京大學(xué)白凡研究員團(tuán)隊與廣州醫(yī)科大學(xué)附屬廣州市婦女兒童醫(yī)療中心兒科研究所張玉霞研究員，國家臨床重點?？苾嚎葡瘓F(tuán)隊（楊敏、耿嵐嵐及龔四堂主任醫(yī)師）合作在《Cell》以長文形式發(fā)表了題為“Mucosal profiling of pediatric-onset colitis and IBD reveals common pathogenic and therapeutic pathways”的研究論文，報道了這一兒童疾病研究領(lǐng)域的重大進(jìn)展。
1. 隊列特征與單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組圖譜
研究團(tuán)隊回顧了2016 ~ 2019年廣州醫(yī)科大學(xué)附屬廣州市婦女兒童醫(yī)療中心消化內(nèi)科招募的306名患兒，并根據(jù)臨床、生化檢驗、內(nèi)鏡和組織病理學(xué)等評分將患兒分為對照、結(jié)腸炎（colitis），潰瘍性結(jié)腸炎（UC）和克羅恩?。–D）組。結(jié)腸炎又分為輕（分級1）、中（分級2）、重度（分級3）三個等級。腸鏡時，中-重度結(jié)腸炎及UC和CD患者的血紅蛋白(HGB)和白蛋白(ALB)顯著降低，而超敏C反應(yīng)蛋白（hsCRP）和血小板計數(shù)則升高（圖1A-C）。為了闡述致病機(jī)制及研究藥物靶點，研究團(tuán)隊對17名患兒（包括對照組及PIBD各亞型）的結(jié)腸黏膜進(jìn)行了單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組及TCR+BCR分析，并將中國兒童的風(fēng)險基因與各細(xì)胞亞型的轉(zhuǎn)錄特征進(jìn)行了關(guān)聯(lián)（圖1D-E）。
圖1 隊列特征與結(jié)腸黏膜單細(xì)胞圖譜
2. 腸上皮細(xì)胞富集風(fēng)險基因
單細(xì)胞測序?qū)⒛c上皮細(xì)胞分為了10個亞群，風(fēng)險基因富集在不同的細(xì)胞亞群上，發(fā)揮的功能不盡相同（圖2）。比如CASP7可能引起腸上皮（coloncytes）凋亡； DVL1可能通過catenin/WNT通路影響上皮細(xì)胞的再生；表達(dá)在Goblet細(xì)胞上的離子通道PIEZO1可能對周圍的力學(xué)環(huán)境比較敏感（圖2D-F）。這些蛋白的失調(diào)最終可能促進(jìn)兒童結(jié)腸炎及炎癥性腸病的發(fā)生發(fā)展。
圖2 PIBD與對照組結(jié)腸上皮細(xì)胞的組成與功能差異
3. 兒童結(jié)腸炎及炎癥性腸病結(jié)腸黏膜富集炎性成纖維細(xì)胞且血管生成增加
結(jié)腸黏膜成纖維細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞共有8個亞群（圖3A）。PIBD的腸黏膜含有大量WNT2B高表達(dá)和炎性成纖維細(xì)胞，這些細(xì)胞富集TNFα, NF-κB和壓力應(yīng)答等通路，其中炎性成纖維細(xì)胞只在UC中富集（圖3B-D）。PIBD中的成纖維細(xì)胞分泌更多的能招募并活化髓系細(xì)胞的CCL和CXCL家族趨化因子（圖3B）。研究團(tuán)隊還發(fā)現(xiàn)疾病組的血管生成以及免疫細(xì)胞跨內(nèi)皮遷移增加（圖3E-F）。
圖3 PIBD與對照組的成纖維與內(nèi)皮細(xì)胞組成與功能差異
4. 兒童結(jié)腸炎及炎癥性腸病結(jié)腸黏膜富集高炎性髓系細(xì)胞
CD68+的髓系細(xì)胞在PIBD中，尤其是UC和CD患者中的浸潤顯著增加（圖4A），且高表達(dá)IL1β和TNFα的巨噬細(xì)胞幾乎只存在PIBD中，這類細(xì)胞中行使降解胞內(nèi)cAMP功能的磷酸二酯酶4B（PDE4B）表達(dá)升高（圖4B-F）。抑制PDE4B可以降低炎癥因子的釋放，研究團(tuán)隊通過體外細(xì)胞實驗證實靶向PDE4B的臨床藥物雙嘧達(dá)莫可以顯著抑制TNFα，IL1β和IL6的釋放（圖4G-I）。
圖4 PIBD結(jié)腸黏膜富集炎性髓系細(xì)胞
5. 結(jié)腸黏膜CD39缺乏誘導(dǎo)血小板活化和5-羥色胺累積
結(jié)合單細(xì)胞測序和免疫細(xì)胞表型分析，研究團(tuán)隊描述了不同T亞群的克隆擴(kuò)增及轉(zhuǎn)化情況（圖5A-F）。值得關(guān)注的是，細(xì)胞表面表達(dá)的核酸外切酶CD39在CD8+和Vδ1+T細(xì)胞的表達(dá)在PIBD各亞型中顯著降低（圖5G）。CD39受cAMP-PKA-ERK-ATF2/CREB調(diào)控，可以降解胞外的ATP和ADP，研究團(tuán)隊證實CD39表達(dá)缺失確實會導(dǎo)致腸黏膜ADP濃度增加，從而激活血小板促進(jìn)5-羥色胺的釋放，最終誘導(dǎo)黏膜損傷；也通過體外細(xì)胞實驗證實了靶向PDE4B的臨床藥物雙嘧達(dá)莫可以提高Navie CD8+T細(xì)胞的CD39表達(dá)（圖5H-I），這與單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析及過往報道提示提高cAMP可能促進(jìn)CD39的表達(dá)相符。
圖5 PIBD結(jié)腸黏膜缺乏CD39+的上皮T淋巴細(xì)胞
6. 雙嘧達(dá)莫在防治兒童結(jié)腸炎及炎癥性腸病方面的應(yīng)用前景
為了證實第二信使激動劑在治療PIBD的應(yīng)用潛力，研究團(tuán)隊利用腹腔注射雙嘧達(dá)莫的方式對硫酸葡聚糖（DSS）誘導(dǎo)的急性腸炎小鼠進(jìn)行了治療，發(fā)現(xiàn)雙嘧達(dá)莫可以顯著改善小鼠的體重、結(jié)腸長度和結(jié)腸的組織病理結(jié)構(gòu)，抑制小鼠結(jié)腸黏膜的血小板聚集和TNFα的釋放（圖6A-D）。對9例患兒（8例結(jié)腸炎和1例未定型IBD）開展了雙嘧達(dá)莫的小隊列臨床試驗，發(fā)現(xiàn)患者的血小板計數(shù)，結(jié)腸鏡評分和臨床綜合評分均有明顯改善（圖6E）。其可能的機(jī)制是雙嘧達(dá)莫通過cAMP-PKA-ERK-ATF2/CREB途徑提高CD39的表達(dá)，從而抑制血小板的聚集和活化（圖6F-G）；同時，該藥可以抑制CD68+髓系細(xì)胞及TNFα的釋放（圖6H），最終緩解臨床癥狀。
圖6 雙嘧達(dá)莫在臨床上可以緩解結(jié)腸炎
總結(jié)：
研究團(tuán)隊利用深度免疫分型并結(jié)合單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)、全基因組關(guān)聯(lián)分析（GWAS）、體外、動物實驗和臨床測試，揭示了結(jié)腸炎和炎癥性腸病患兒腸黏膜多個細(xì)胞亞型中的cAMP通路被抑制，從而導(dǎo)致級聯(lián)免疫紊亂并最終促進(jìn)了PIBD的發(fā)生發(fā)展（圖7）。本文還發(fā)現(xiàn)了胞內(nèi)第二信使激動劑雙嘧達(dá)莫可以提高cAMP，增加CD39的表達(dá)，抑制炎性因子分泌和血小板活化，從而為兒童結(jié)腸炎及炎癥性腸病的防治開拓了新的領(lǐng)域（圖7）。未來，此類藥物可能會成為兒童和/或成人胃腸炎癥疾病的另一種臨床防治選擇，有助于降低醫(yī)療成本，促進(jìn)社會和諧。但是因臨床環(huán)境較為復(fù)雜，潘生丁的使用需要繼續(xù)進(jìn)行臨床實驗。具體用藥請咨詢臨床醫(yī)生。
圖7 本課題的技術(shù)路線與致病機(jī)制
廣州醫(yī)科大學(xué)附屬廣州市婦女兒童醫(yī)療中心兒科研究所黃冰博士，北京大學(xué)生物醫(yī)學(xué)前沿創(chuàng)新中心的陳章華博士研究生，以及廣州醫(yī)科大學(xué)附屬廣州市婦女兒童醫(yī)療中心兒科研究所的王俊副研究員，消化科耿嵐嵐主任醫(yī)師和數(shù)據(jù)中心梁會營主任為本文的并列第一作者，張玉霞、楊敏、白凡和龔四堂為本文的共同通訊作者。
合作團(tuán)隊聲明本文所述實驗，均經(jīng)過廣州醫(yī)科大學(xué)附屬廣州市婦女兒童醫(yī)療中心倫理委員會，中國臨床試驗注冊中心，以及廣州醫(yī)科大學(xué)動物實驗倫理委員會的批準(zhǔn)和通過，并嚴(yán)格按照批件所述的要求和流程實施。實驗所涉及的遺傳數(shù)據(jù)遵循國家管理辦法進(jìn)行儲存和備案。
原文鏈接：
https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(19)31177-8
白凡 簡介：北京大學(xué)生物醫(yī)學(xué)前沿創(chuàng)新中心、生命科學(xué)學(xué)院研究員，博士生導(dǎo)師，國家自然科學(xué)基金委優(yōu)秀青年基金獲得者。2003年本科畢業(yè)于北京大學(xué)物理系，2008年獲英國牛津大學(xué)生物物理博士學(xué)位。全職回國之后，白凡實驗室致力于將先進(jìn)的單細(xì)胞技術(shù)應(yīng)用于重大醫(yī)學(xué)疾病問題的研究，在癌癥轉(zhuǎn)移和異質(zhì)性研究領(lǐng)域和細(xì)菌抗生素耐藥研究領(lǐng)域取得多項重大研究成果，已在Science, Nature, Cell, Cancer Cell, Molecular Cell, PNAS等著名學(xué)術(shù)期刊發(fā)表論文60余篇。
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