我院王永明團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)了一種高靈敏度的Cas12a可視化核酸檢測(cè)方法
核酸快速檢測(cè)對(duì)于臨床診斷和生物技術(shù)應(yīng)用不可或缺。最近，基于CRISPR系統(tǒng)的基因編輯技術(shù)也被應(yīng)用于基因檢測(cè)。借助于Cas13a和Cas12a的附帶切割活性開(kāi)發(fā)的SHERLOCK系統(tǒng)，DETECTR系統(tǒng)和HOLMES系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了針對(duì)病原體和腫瘤基因的精準(zhǔn)檢測(cè)。但是，在這些檢測(cè)系統(tǒng)中通常將核酸擴(kuò)增和檢測(cè)步驟分開(kāi)，開(kāi)蓋操作極易造成擴(kuò)增子氣溶膠污染，產(chǎn)生 “假陽(yáng)性”結(jié)果。此外，目前的CRISPR檢測(cè)技術(shù)需要借助熒光設(shè)備，并且至少需要一個(gè)小時(shí)才能完成，不適用于低成本的核酸現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。
針對(duì)這一問(wèn)題，王永明團(tuán)隊(duì)探索了重組聚合酶擴(kuò)增和Cas12a切割兼容的體系，并且開(kāi)發(fā)了Cas12aVDet (Cas12a-based Visual Detection)可視化檢測(cè)方法，首次將核酸擴(kuò)增和檢測(cè)體系置于同一反應(yīng)管中，反應(yīng)完成后在藍(lán)光激發(fā)下直接通過(guò)肉眼觀察結(jié)果，整個(gè)過(guò)程可在30 min內(nèi)完成。該方法操作簡(jiǎn)便，檢測(cè)快速，檢測(cè)結(jié)果肉眼可見(jiàn)，檢測(cè)靈敏度達(dá)到單分子水平。相關(guān)成果于2019年8月28日以“Cas12aVDet: a CRISPR/Cas12a-based platform forrapid and visual nucleic acid detection”為題在線發(fā)表在美國(guó)化學(xué)會(huì)《American Chemical Society》旗下主要期刊《分析化學(xué)》（Analytical Chemistry）上。
圖1 Cas12aVDet可視化核酸快速檢測(cè)方法原理圖
如上圖所示，該方法首先將RPA擴(kuò)增試劑和除Cas12a酶外的Cas12a切割體系試劑混勻后置于管內(nèi)，Cas12a酶置于管壁。然后，在37℃條件下反應(yīng)15min進(jìn)行RPA擴(kuò)增。隨后，將Cas12a酶離心到反應(yīng)液中在37℃條件下繼續(xù)反應(yīng)15min進(jìn)行Cas12a切割。最后，在藍(lán)光燈激發(fā)下通過(guò)肉眼觀察檢測(cè)結(jié)果，陽(yáng)性樣本將呈現(xiàn)出明亮的綠色熒光，陰性樣本無(wú)熒光產(chǎn)生。研究發(fā)現(xiàn)，Cas12aVDet方法可實(shí)現(xiàn)對(duì)核酸的快速檢測(cè)，檢測(cè)靈敏度可達(dá)到單分子水平。該方法成本低廉，操作簡(jiǎn)便，在疾病診斷、致病菌檢測(cè)以及便攜式檢測(cè)設(shè)備開(kāi)發(fā)中具有極大的應(yīng)用潛力。
圖2針對(duì)靶位點(diǎn)設(shè)計(jì)的特異性識(shí)別序列及其核酸熒光檢測(cè)結(jié)果圖
通過(guò)檢測(cè)質(zhì)粒上的靶位點(diǎn)對(duì)Cas12aVDet可視化檢測(cè)體系進(jìn)行評(píng)估。首先，針對(duì)靶位點(diǎn)分別設(shè)計(jì)crRNA1和crRNA2特異性識(shí)別序列（如圖a所示）。接著，采用Cas12aVDet可視化檢測(cè)體系進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)熒光值和可視化檢測(cè)結(jié)果的對(duì)比數(shù)據(jù)如圖b所示。結(jié)果顯示陽(yáng)性樣本呈現(xiàn)出強(qiáng)烈的綠色熒光，可與陰性樣本進(jìn)行明顯區(qū)分，檢測(cè)結(jié)果可采用肉眼觀察或手機(jī)拍照。
王永明課題組的碩士生王貝和浙江大學(xué)博士生王瑞為該論文的共同第一作者，王永明教授為該論文的通訊作者。
全文鏈接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.analchem.9b01526
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