溫文玉團隊在《Nature Communications》揭示神經(jīng)干細胞不對稱分裂的相分離調(diào)控新機制
細胞極性是大部分細胞都具有的基本性質(zhì)，具體表現(xiàn)為細胞形態(tài)的不對稱性以及胞內(nèi)細胞器、蛋白質(zhì)及核酸等組分的不對稱分布，對于細胞的分化、發(fā)育與功能發(fā)揮起著舉足輕重的作用，其破壞與發(fā)育缺陷、腫瘤生成及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。無論是神經(jīng)元、上皮細胞中長期維持的極性，還是細胞分化、遷移過程中涉及的瞬時極性，細胞極化的共性，是一些極性調(diào)控蛋白質(zhì)被特異地招募到指定膜區(qū)域，并發(fā)生顯著的局部聚集。值得注意的是，這些蛋白質(zhì)（如Par3/Par6/aPKC，F(xiàn)rizzled/Dishevelled/Diego復(fù)合物等）往往通過相互作用自發(fā)形成高度聚集的塊狀或點狀結(jié)構(gòu)，附著于細胞質(zhì)膜內(nèi)表面，并可快速地響應(yīng)細胞信號發(fā)生去組裝。然而這些蛋白復(fù)合物如何能在開放接觸胞質(zhì)的前提上實現(xiàn)極性聚集，同時又保持高度的動態(tài)性，一直是一個懸而未決的問題。
近年來，生物大分子的“液-液相分離”（liquid-liquid phase separation， LLPS）被證明是細胞內(nèi)多種沒有脂膜包被的無膜細胞器的重要形成機理。極性復(fù)合物聚集體也具有這些無膜細胞器的類似特征，如高度凝聚性、動態(tài)性等。我院溫文玉課題組與新加坡國立大學(xué)淡馬錫生命科學(xué)研究院蔡毓課題組前期已經(jīng)證實，在果蠅神經(jīng)干細胞（Neuroblast）不對稱分裂過程中，細胞命運決定因子Numb和連接蛋白Pon之間多位點結(jié)合導(dǎo)致的液-液相分離介導(dǎo)了Numb在神經(jīng)干細胞底端皮層的極性富集，進而調(diào)控了神經(jīng)干細胞的分化。
2020年5月8日，我院溫文玉組和蔡毓組再次合作，在Nature Communications雜志上在線發(fā)表了題為“Par complex cluster formation mediated by phase separation”的研究工作，發(fā)現(xiàn)神經(jīng)干細胞不對稱分裂過程中，Par蛋白復(fù)合物(Par3/Par6/aPKC)也是通過相分離的方式進行組裝，進而調(diào)控頂-底細胞極性軸的建立以及神經(jīng)元的分化。研究者進一步提出，極性蛋白復(fù)合物多價相互作用介導(dǎo)的液-液相分離可能是細胞極性建立的普遍機制。
作為最早被報道的極性調(diào)控復(fù)合物，高度保守的Par復(fù)合物由Par3（果蠅中為Bazooka），Par6和aPKC組成，三者可以兩兩相互結(jié)合形成一個極性核心，并進一步招募其他蛋白發(fā)揮功能。以果蠅神經(jīng)干細胞的不對稱分裂過程為例，在細胞分裂開始時，均勻分布的Baz/Par6/aPKC逐漸聚集在細胞的頂端皮層，而細胞命運決定因子及其銜接蛋白（包括Numb/Pon復(fù)合物）在aPKC磷酸化的調(diào)控下，脫離頂端皮層，進而在細胞底端聚集，從而建立了頂-底端極性。極性分布于細胞兩端的蛋白質(zhì)及RNA隨即被不均一地分離到兩個子細胞中，從而使其具有不同的命運。細胞分裂完成后，細胞兩端的蛋白聚集體去組裝以進行下一輪的循環(huán)。在這項最新工作中，研究者發(fā)現(xiàn)Par復(fù)合物隨著細胞周期，以液滴的形式凝聚于頂部皮層上。進一步體外及細胞內(nèi)過表達實驗表明，Par3由于其NTD結(jié)構(gòu)域的寡聚可發(fā)生液液相分離現(xiàn)象，Par6通過其C末端氨基酸與Par3 PDZ3的特異結(jié)合而被富集到Par3凝聚體中，同時極大地促進了Par3的相分離能力。
作為復(fù)合物中唯一的激酶，aPKC也可以被招募并富集在Par3/Par6凝聚體中，但是凝聚體中的aPKC處于非活性狀態(tài)。重要的是，激活的aPKC可以磷酸化Par3，并促使Par凝聚體解離。研究者推測，Par凝聚相液滴的形成可能是將胞質(zhì)中有限的aPKC轉(zhuǎn)運至局部膜區(qū)域的一種有效方式。在到達特定膜區(qū)域后，aPKC可在其他調(diào)節(jié)因子（如Cdc42）的作用下激活，進而通過磷酸化Par3使得Par復(fù)合物凝聚體解聚；同時，激活的aPKC可發(fā)揮其激酶活性以介導(dǎo)細胞命運決定因子的底部定位。干擾Par3/Par6液液相分離的形成會破壞果蠅神經(jīng)干細胞不對稱分裂過程中頂-底端極性的建立，進而導(dǎo)致神經(jīng)元譜系發(fā)育的缺陷（圖1）。結(jié)合前期工作，該研究表明極性蛋白復(fù)合物多價相互作用介導(dǎo)的液液相分離可能是細胞極性建立的普遍機制。
盡管液-液相分離為細胞中大量無膜細胞器的形成、以及多種生理過程中細胞組分的選擇性濃縮和分離機制提供了一個全新的視角，其在生理條件下是否真正調(diào)控這些生物學(xué)過程一直是爭論的焦點。畢竟相分離體現(xiàn)出極大的蛋白濃度依賴性，而在體外實驗與細胞內(nèi)過表達體系中，目標蛋白的濃度可能遠大于生理濃度。為了解決這一問題，該論文研究者通過設(shè)計GFP標簽的Baz敲入果蠅，探討了內(nèi)源表達量條件下Par復(fù)合物相分離對于極性建立的調(diào)控。出乎意料的是，對于缺失NTD結(jié)構(gòu)域、低相分離能力的Baz ΔNTD突變體，在轉(zhuǎn)基因果蠅的過表達體系中會造成>80%的神經(jīng)干細胞極性喪失；而在敲入果蠅中，絕大部分神經(jīng)干細胞里的Par復(fù)合物都可觀察到頂部皮層的聚集，但伴隨有明顯的胞質(zhì)擴散現(xiàn)象，進而造成發(fā)育后腦尺寸的減小。更重要的是，如果用無二級結(jié)構(gòu)，但可發(fā)生相分離的FUS的LCD片段替換Baz NTD結(jié)構(gòu)域，可以顯著挽救NTD缺失造成的腦發(fā)育異常（圖1）。這一結(jié)果為相分離介導(dǎo)的Par復(fù)合物極性分布及極性建立提供了強有力的數(shù)據(jù)，同時也指出了過表達體系對于研究相分離生理意義的缺陷。
圖1 Par復(fù)合物相分離調(diào)控神經(jīng)干細胞極性建立
綜上所述，這項研究揭示了極性蛋白復(fù)合物Par3/Par6/aPKC通過多價相互作用引起的相分離促進了其在局部膜區(qū)域的凝聚，而相分離凝聚體對于細胞信號的快速反應(yīng)也保證了極性建立與解除的高度動態(tài)性。由于大多極性復(fù)合物都具有類似的多位點結(jié)合模式，以及動態(tài)分布規(guī)律，該研究提出的蛋白質(zhì)相分離可能是調(diào)控細胞極性的普適性規(guī)律。
復(fù)旦大學(xué)博士生劉子亨、碩士生顧愛紅，以及新加坡國立大學(xué)楊迎博士為論文共同第一作者，復(fù)旦大學(xué)溫文玉研究員和新加坡國立大學(xué)蔡毓教授為論文的共同通訊作者。該課題還得到了首都師范大學(xué)李周華教授、香港科技大學(xué)張明杰教授等的大力支持。
原文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41467-020-16135-6
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