于文強(qiáng)團(tuán)隊(duì)開發(fā)了全基因組DNA甲基化導(dǎo)航定位測序，揭示DNA甲基化調(diào)控新模式，提出腫瘤轉(zhuǎn)移新機(jī)制
如果您專注于以下科學(xué)問題，那您一定會(huì)對(duì)我們所做的研究和發(fā)表的文章感興趣：
1.DNA甲基化檢測如何精準(zhǔn)檢測，同時(shí)花費(fèi)最少？2. 啟動(dòng)子DNA甲基化和基因體甲基化如何協(xié)同調(diào)節(jié)基因的表達(dá)？3. DNA甲基化還有沒有其他的調(diào)控模式？腫瘤基因如C-myc 為何會(huì)在腫瘤中高表達(dá)，其機(jī)制是什么？4.腫瘤免疫耐受與腫瘤細(xì)胞自身的表觀遺傳學(xué)調(diào)控有什么關(guān)系？5.腫瘤細(xì)胞為什么會(huì)有特異性的器官轉(zhuǎn)移？ 我們的研究也許會(huì)幫助您打開解決這些問題的另一扇門，獲得與眾不同的靈感!
隨著人類基因組計(jì)劃的完成，生命科學(xué)研究進(jìn)入了“后基因組時(shí)代”，而表觀遺傳學(xué)是“后基因組時(shí)代”的前沿方向。DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)的核心組成部分，對(duì)于正常細(xì)胞功能維持、胚胎發(fā)育等生命過程至關(guān)重要，DNA甲基化紊亂與腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移具有密切關(guān)系。因此，進(jìn)行全基因組DNA甲基化的檢測和分析對(duì)于探索腫瘤的發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)機(jī)制以及開發(fā)新的抗腫瘤策略具有重要意義。
近日，復(fù)旦大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院教授于**團(tuán)隊(duì)開發(fā)了具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的全基因組 DNA 甲基化檢測技術(shù)——導(dǎo)航定位測序（Guide Positioning Sequencing，GPS）。相比于 WGBS，GPS 具有覆蓋率高（高達(dá)96%）、可覆蓋GC-rich區(qū)域和重復(fù)序列區(qū)域。利用 GPS對(duì)正常肝細(xì)胞和肝癌細(xì)胞進(jìn)行全基因甲基化測序，分析發(fā)現(xiàn)基因體（gene body）和啟動(dòng)子之間的甲基化差異（methylation of gene body difference to promoter，MeGDP）可有效地預(yù)測基因表達(dá)，啟動(dòng)子和增強(qiáng)子中的“甲基化邊界移動(dòng)（Methylation Boundary Shift，MBS）”能夠調(diào)控與免疫和腫瘤代謝相關(guān)的基因的表達(dá)，異常的 DNA 甲基化參與了組織特異性的增強(qiáng)子轉(zhuǎn)換，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞身份的轉(zhuǎn)變和肝癌發(fā)生發(fā)展以及肝癌的特異性肺轉(zhuǎn)移，相關(guān)研究于2019年1月22日發(fā)表在線發(fā)表于Genome Research上。
GPS檢測DNA甲基化，優(yōu)勢看得見。目前全基因組 DNA 甲基化檢測的“金標(biāo)準(zhǔn)”為重亞硫酸鹽測序（Bisulfite-sequencing），結(jié)合二代測序，能夠以單堿基分辨率檢測全基因組范圍的 DNA 甲基化。然而，重亞硫酸鹽測序的生物信息學(xué)分析固有的缺陷造成測序的不準(zhǔn)確性和高昂的測序成本。于**教授團(tuán)隊(duì)歷時(shí)八年，開發(fā)了一套新的全基因組 DNA 甲基化檢測技術(shù)——導(dǎo)向定位測序（Guide Positioning Sequencing，GPS），相比于目前最廣泛使用的 WGBS，GPS 具有以下優(yōu)點(diǎn): 1. 單堿基分辨率的全基因組DNA甲基化位點(diǎn)檢測；2.能夠區(qū)分DNA模板正負(fù)鏈甲基化； 3. 能夠覆蓋基因組幾乎所有重復(fù)片段；4. 檢測費(fèi)用大幅下降； 5.GPS可以同時(shí)檢測基因組和表觀基因組信息。應(yīng)用 GPS 檢測正常肝細(xì)胞以及兩個(gè)肝癌細(xì)胞系 97L 和 LM3 中全基因組 DNA 甲基化發(fā)現(xiàn)，在人類正常肝細(xì)胞中，GPS 對(duì) CpG 位點(diǎn)覆蓋率達(dá) 97%，胞嘧啶的覆蓋率達(dá) 96%；在肝癌細(xì)胞系 97L 細(xì)胞中，GPS 的比對(duì)率為 80.9%，比 WGBS 的覆蓋率高 15～20%。
GPS 工作原理以及與 WGBS 的比較
MeGDP開啟腫瘤內(nèi)源性甲基化與腫瘤免疫耐受研究的新篇章。啟動(dòng)子區(qū)域的DNA甲基化與基因的表達(dá)沉默有關(guān)，但從全基因組水平來看，啟動(dòng)子區(qū)域的DNA甲基化與基因表達(dá)沒有關(guān)系。通過對(duì)GPS檢測數(shù)據(jù)的分析，我們發(fā)現(xiàn)基因體和啟動(dòng)子區(qū)域的 DNA 甲基化差異與基因表達(dá)之間存在很強(qiáng)的相關(guān)性，并將基因體和啟動(dòng)子區(qū)域的 DNA 甲基化差異定義為 MeGDP（methylation of gene body difference to promoter）。MeGDP 與基因表達(dá)之間的相關(guān)系數(shù) Rho 高達(dá) 0.67，提示 MeGDP 可以做為基因表達(dá)的預(yù)測因子。在肝癌細(xì)胞中，MeGDP 降低與免疫系統(tǒng)以及代謝紊亂相關(guān)。這些結(jié)果提示，在腫瘤發(fā)展過程中，腫瘤細(xì)胞自身內(nèi)源性的免疫相關(guān)的分子通過 DNA 甲基化沉默可能是腫瘤細(xì)胞免疫逃逸的重要原因。
MBS，DNA甲基化調(diào)控基因表達(dá)的新模式。我們經(jīng)常會(huì)遇到即使啟動(dòng)子的區(qū)域DNA低甲基化，但基因表達(dá)水平還是不同。我們通過分析啟動(dòng)子區(qū)域的DNA低甲基化區(qū)域的寬度，發(fā)現(xiàn)相比于正常肝細(xì)胞而言，腫瘤細(xì)胞可能在啟動(dòng)子區(qū)域有更寬的低甲基化。我們將轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)附近的 DNA 甲基化邊界變化命名為“甲基化邊界漂移“，即MBS（Methylation Boundary Shift，MBS）”。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，MBS向TSS下游的延伸與基因的高表達(dá)有關(guān)，而這些高表達(dá)的基因與核糖體基因的合成和細(xì)胞周期相關(guān)，而這些基因無疑與腫瘤密切相關(guān)。
增強(qiáng)子做為重要的順式調(diào)控原件，同樣受到MBS的調(diào)控。與正常肝細(xì)胞相比，研究發(fā)現(xiàn) 97L 細(xì)胞通過MBS改變了增強(qiáng)子的狀態(tài)，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞中增強(qiáng)子的獲得或丟失，而增強(qiáng)子區(qū)域的異常 DNA 甲基化模式可能調(diào)改變強(qiáng)子特性以及所調(diào)控的基因表達(dá)，賦予腫瘤細(xì)胞新的特性，繼而與腫瘤的發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移有關(guān)。
MBS 與增強(qiáng)子的改變相一致
“同化共生”，腫瘤轉(zhuǎn)移的新機(jī)制。物以類聚，人以群分，腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移也一樣。腫瘤轉(zhuǎn)移是腫瘤治療失敗的重要原因之一，而腫瘤特異性的器官轉(zhuǎn)移機(jī)制并不清楚。例如肝癌容易發(fā)生肺轉(zhuǎn)移，我們通過分析肝癌細(xì)胞97L和肝癌特異性轉(zhuǎn)移到肺的LM3細(xì)胞的DNA甲基化模式和基因表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞特異性的基因表達(dá)降低，而肺細(xì)胞特異性的基因表達(dá)上調(diào)提示肝細(xì)胞身份丟失和肺細(xì)胞身份的獲得是肝癌發(fā)生肺轉(zhuǎn)移的重要原因。 我們的結(jié)果表明，在97L 和 LM3 肝癌細(xì)胞系中，肝特異性高表達(dá)的基因的數(shù)目分別降低了 74% 和 80%；而肺特異性 CKS2 在 97L 和 LM3 中的表達(dá)升高，與此同時(shí)，在肝癌細(xì)胞中的肝特異性增強(qiáng)子減少和肺特異性的增強(qiáng)子增加與 DNA 甲基化異常模式相關(guān)。我們認(rèn)為增強(qiáng)子區(qū)域異常的 DNA 甲基化異常模式可以調(diào)控增強(qiáng)子的漂移并影響相關(guān)靶基因的表達(dá)。我們認(rèn)為腫瘤細(xì)胞通過改變身份，與特異性轉(zhuǎn)移的器官組織細(xì)胞通過表觀遺傳學(xué)的機(jī)制，進(jìn)而“同化共生“，肝癌細(xì)胞中表達(dá)的肺特異性的基因可以幫助肝癌細(xì)胞更好地適應(yīng)肺環(huán)境，提示腫瘤細(xì)胞身份的丟失以及其他細(xì)胞身份的獲得是腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移的重要原因，而同化共生可能是腫瘤發(fā)生特異性器官轉(zhuǎn)移的重要分子機(jī)制。
具有肺轉(zhuǎn)移潛能的肝癌細(xì)胞中肝特異性基因表達(dá)降低，而肺特異性基因表達(dá)升高
復(fù)旦大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院博士李晉、李巖，助理研究員李偉，博士羅懷兵，博士后奚艷萍，博士生董世華，國防科技大學(xué)博士高明為本文共同第一作者，復(fù)旦大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院于**研究員，吳飛珍助理研究員以及國防科技大學(xué)彭邵亮教授為本文共同通訊作者。本研究得到了科技部、上海市科委基礎(chǔ)研究重大專項(xiàng)、上海市“科技創(chuàng)新行動(dòng)計(jì)劃”、國家自然科學(xué)基金、國家“863”計(jì)劃等經(jīng)費(fèi)的支持。
原文鏈接：https://genome.cshlp.org/content/early/2019/01/21/gr.240606.118.abstract
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