復旦大學生物醫(yī)學研究院顧宏周課題組報道脫氧核酶的活性改進
2018年05月24日，生物醫(yī)學研究院顧宏周課題組與中山醫(yī)院李華課題組聯(lián)合在《ACS Catalysis》上在線發(fā)表了題為《 Retraining and Optimizing DNA-hydrolyzing Deoxyribozymes for Robust Single- and Multiple-turnover Activities》的研究論文，揭示了脫氧核酶（deoxyribozymes）的優(yōu)化策略和在生物工程技術方面的潛在應用價值。
脫氧核酶是一類特定序列的具有酶活性的單鏈DNA，可通過“試管內(nèi)進化”的方法獲得。自1994年首次發(fā)現(xiàn)以來，已有幾十種催化不同反應的脫氧核酶被分離來，包括DNA磷酸化、腺苷化、去糖基化，DNA/RNA連接，RNA切割，以及DNA磷酸二酯鍵水解等。這類由DNA構(gòu)成的酶在細胞內(nèi)天然存在的證據(jù)依然在探索中，但將其用于細胞內(nèi)干預特定的信號通路從而抑制腫瘤的發(fā)生和生長已得到了廣泛認可和現(xiàn)實應用。
圖1. I-R1的突變型分子中突變位點及突變型的反應速率測試
與蛋白酶相比較，已知的脫氧核酶在單個turnover周期內(nèi)的反應速率和多個turnover間的轉(zhuǎn)換率都有一定的差距。聯(lián)合課題組以特異感應鋅離子并在特定位點水解切割DNA的I類脫氧核酶為例，對其已知的序列作退化處理構(gòu)建初始DNA文庫，通過體外再次篩選分離得到了脫氧核酶I-R1亞型的三個突變體：I-R1a-c（圖1）。與I-R1相比，突變體單個turnover內(nèi)的反應速率均提高了10倍以上，半衰期縮短到1分鐘左右，達到或接近蛋白酶和RNA酶在體外被觀察到的反應速率。同時，聯(lián)合課題組通過簡單的熱循環(huán)操作促進底物和酶之間的結(jié)合及分離（圖2），將Ι類脫氧核酶的turnover間的轉(zhuǎn)換率提高了約30倍，有效kcat值達到了0.5 min-1，同樣接近于蛋白酶的體外活性。該研究為脫氧核酶的系統(tǒng)性優(yōu)化提供了一種廣泛適用的策略，同時也為可水解切割DNA的脫氧核酶作為一種高效的分子生物學工具奠定了基礎。
圖2. 熱循環(huán)促進的multiple-turnover反應示意圖
復旦大學顧宏周研究員和李華研究員為論文的共同通訊作者，復旦大學生物醫(yī)學研究院博士生杜鑫雨和復旦大學附屬中山醫(yī)院博士生仲昕醫(yī)師為論文的共同第一作者。
論文原文鏈接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acscatal.8b01466
Xinyu Du,# Xin Zhong,# Wei Li, Hua Li,* Hongzhou Gu.* “Retraining and Optimizing DNA-hydrolyzing Deoxyribozymes for Robust Single- and Multiple-turnover Activities.” ACS Catalysis 2018, DOI: 10.1021/acscatal.8b01466
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