高紹榮教授和江賜忠教授團(tuán)隊(duì)合作在《Nature Communications》發(fā)文揭示小鼠體細(xì)胞核移植過程中染色質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)重編程模式及分子機(jī)制
2020年4月14日，同濟(jì)大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院高紹榮團(tuán)隊(duì)與江賜忠團(tuán)隊(duì)在《Nature Communications》 雜志在線發(fā)表了題為“Chromatin architecture reorganization in murine somatic cell nuclear transfer embryos”的研究成果。他們采用了經(jīng)過優(yōu)化的少量細(xì)胞全基因組染色質(zhì)構(gòu)象捕獲技術(shù)（sisHi-C），對小鼠SCNT胚胎發(fā)育過程進(jìn)行連續(xù)采樣，并詳細(xì)描繪了SCNT植入前胚胎染色質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)變化過程。
體細(xì)胞核移植（SCNT）技術(shù)是將已經(jīng)分化的體細(xì)胞移入去核卵母細(xì)胞內(nèi)，使體細(xì)胞的染色質(zhì)發(fā)生重編程，繼而重啟胚胎發(fā)育過程并獲得完整個(gè)體的技術(shù)。雖然SCNT是目前為止唯一一種可以使體細(xì)胞獲得完整全能性的手段，但是由于在重編程過程中出現(xiàn)了各種表觀遺傳水平修飾的異常，使得SCNT胚胎的發(fā)育能力處于較低水平，也極大程度地限制了該項(xiàng)技術(shù)的應(yīng)用前景。高紹榮教授團(tuán)隊(duì)長期致力于小鼠SCNT胚胎發(fā)育異常原因的探索。2016年通過對早期克隆胚胎進(jìn)行卵裂球活檢，并結(jié)合單細(xì)胞RNA測序技術(shù)首次建立了植入前核移植胚胎發(fā)育命運(yùn)追蹤系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)了組蛋白去甲基化酶Kdm4b和Kdm5b分別對克隆胚胎2-細(xì)胞和4-細(xì)胞時(shí)期的發(fā)育阻滯起到關(guān)鍵作用。兩年后，又通過對不同發(fā)育命運(yùn)體細(xì)胞克隆胚胎進(jìn)行全基因組DNA甲基化高通量測序分析，詳細(xì)地研究了小鼠克隆胚胎著床前發(fā)育過程中DNA甲基化修飾的重編程過程，并揭示了異常的DNA再甲基化（DNA re-methylation）是導(dǎo)致克隆胚胎著床后發(fā)育異常的關(guān)鍵因素。在哺乳動(dòng)物中，染色質(zhì)三維結(jié)構(gòu)對基因的調(diào)控起著非常重要的作用。但是，受制于小鼠SCNT胚胎樣本取材困難和Hi-C技術(shù)對細(xì)胞樣本起始量高的限制，小鼠SCNT植入前胚胎發(fā)育過程中染色質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)變化過程尚未被全面研究過。
在本研究中，研究人員收集了核移植后多個(gè)時(shí)間點(diǎn)的胚胎并利用優(yōu)化的微量細(xì)胞sisHi-C技術(shù)對染色質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了檢測，通過數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，在體細(xì)胞核被注射到去核的卵細(xì)胞后，隨著典型三維染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的消解，供核體細(xì)胞染色質(zhì)的近距離相互作用優(yōu)先解開，并迅速由間期轉(zhuǎn)化為類中期狀態(tài)。在這期間出現(xiàn)了一個(gè)非常有趣的現(xiàn)象，當(dāng)供體細(xì)胞在去核卵母細(xì)胞中被人工激活1個(gè)小時(shí)后，基因組經(jīng)歷了從類有絲分裂中期向類第二次減數(shù)分裂中期的轉(zhuǎn)變（圖1）。
圖1. SCNT胚胎基因組在短時(shí)間內(nèi)由有絲分裂類中期轉(zhuǎn)變?yōu)闇p數(shù)分裂類中期
在SCNT胚胎發(fā)育6小時(shí)進(jìn)入類原核期（對應(yīng)正常受精胚胎PN3時(shí)期）后，重新出現(xiàn)了較弱的區(qū)室結(jié)構(gòu)和拓?fù)湎嚓P(guān)結(jié)構(gòu)域（TADs）信號(hào)，這很可能是再次退出中期的結(jié)果。隨后，TADs信號(hào)在一細(xì)胞晚期逐漸減弱，直到2細(xì)胞早期降到最低值，在2細(xì)胞晚期到8細(xì)胞卵裂期逐步重新建立，直到囊胚期成熟（圖2）。
圖2. SCNT胚胎發(fā)育各個(gè)階段的TAD強(qiáng)弱變化
隨后研究人員將小鼠SCNT與正常受精胚胎發(fā)育sisHi-C公共數(shù)據(jù)集進(jìn)行比較分析后發(fā)現(xiàn)，SCNT胚胎在2細(xì)胞期的遠(yuǎn)距離（>2 Mb）相互作用較正常受精胚胎明顯降低。同時(shí)，早期（2到8細(xì)胞期）受精胚胎與SCNT胚胎的區(qū)室結(jié)構(gòu)及TADs也存在著明顯的差異。
前期的很多研究表面小鼠SCNT胚胎在合子基因組激活（ZGA）時(shí)期有大量的基因未能被正常激活。于是，研究人員想到染色質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的異常是否會(huì)導(dǎo)致增強(qiáng)子與啟動(dòng)子之間的相互作用無法成功建立？結(jié)果表明，在小鼠正常受精卵的ZGA時(shí)期的關(guān)鍵基因Zscan4d的啟動(dòng)子與上游的超級(jí)增強(qiáng)子有著強(qiáng)烈的相互作用，而這種互作卻無法在SCNT胚胎中被觀察到（圖3）。這類基因的激活異常很可能就是SCNT胚胎發(fā)育能力低下的原因之一。那么，造成染色質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)的異常的原因究竟是什么呢？研究人員證實(shí)這是由于供體細(xì)胞基因組中持續(xù)存在的組蛋白H3K9me3修飾無法被正常擦除造成的。通過在SCNT胚胎中過量表達(dá)組蛋白去甲基化酶Kdm4d來降低H3K9me3修飾水平， SCNT胚胎的染色質(zhì)空間構(gòu)象會(huì)趨向正常受精胚胎，且Zscan4d的啟動(dòng)子與超級(jí)增強(qiáng)子的互作也得到了部分的修復(fù)（圖3）。這說明H3K9me3修飾是核移植胚胎中染色質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)重編程的重要障礙，也證實(shí)了在胚胎基因表達(dá)調(diào)控過程中組蛋白修飾和染色質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)的協(xié)同作用。
圖3. SE-P互作異常影響ZGA相關(guān)基因表達(dá)，并能被過量表達(dá)Kdm4d部分糾正
綜上，這項(xiàng)研究對小鼠SCNT胚胎發(fā)育過程中的染色質(zhì)三維結(jié)構(gòu)重塑進(jìn)行了系統(tǒng)的研究，這也為今后進(jìn)一步糾正SCNT胚胎發(fā)育過程中的表觀遺傳屏障提供了新的思路。
圖4本研究的模式圖
同濟(jì)大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院博士研究生陳墨、朱乾書和李翀副研究員為本文共同第一作者，高紹榮教授、江賜忠教授和劉曉雨研究員為本文共同通訊作者。該研究得到了科技部、基金委和上海市科委項(xiàng)目的支持。
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