毛志勇教授團(tuán)隊建立新的DNA修復(fù)檢測系統(tǒng)并闡述PARP1-SIRT1-BRG1信號軸在HR修復(fù)中的染色質(zhì)密度調(diào)控機(jī)制
2019年7月10日，同濟(jì)大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院毛志勇教授課題組在《Nucleic acids research》上在線發(fā)表了題為“A PARP1-BRG1-SIRT1 axis promotes HR repair by reducing nucleosome density at DNA damage sites”的文章。該研究建立了一種基于紅色和綠色熒光的易于量化的新型DNA雙鏈斷裂修復(fù)（double strand break repair, DSBR）檢測手段；利用該方法，研究團(tuán)隊深入闡述了PARP1-SIRT1-BRG1信號軸在HR修復(fù)中的染色質(zhì)密度調(diào)控功能。
DNA雙鏈斷裂是對細(xì)胞危害最為嚴(yán)重的一類DNA損傷，而DSBR會高效修復(fù)這種損傷以求將對細(xì)胞的損害降到最低。DSBR可主要分為兩大類，一類依靠姐妹染色單體上的同源序列指導(dǎo)修復(fù)的精確進(jìn)行，稱為同源重組（Homologous recombination, HR）；而另一類則直接將斷裂末端相連，往往造成DNA片段的插入或缺失，稱為非同源末端連接（Non-homologous end joining, NHEJ）。這兩條通路的修復(fù)效率以及通路間的選擇與平衡伴隨著機(jī)體的生長發(fā)育以及多種疾病的發(fā)生發(fā)展不斷動態(tài)變化，因此準(zhǔn)確定量地分析染色質(zhì)特定位點的HR與NHEJ效率及其之間的選擇與平衡有利于人們從基因組穩(wěn)定性的角度更深入地理解生、老、病、死的生物學(xué)過程。
為發(fā)展一種新型的檢測手段以同時分析兩條通路的相互關(guān)系，團(tuán)隊基于綠色熒光蛋白GFP與紅色熒光蛋白tdTomato構(gòu)建了一種雙報告載體并將其整合至細(xì)胞系中。在通過外源轉(zhuǎn)入內(nèi)切酶I-SceI從而誘導(dǎo)載體發(fā)生定點雙鏈斷裂后，成功通過HR修復(fù)損傷的細(xì)胞會發(fā)出紅色熒光，而通過NHEJ完成修復(fù)的細(xì)胞則會發(fā)出綠色熒光。利用流式細(xì)胞技術(shù)，研究者便可同時定量分析成功發(fā)生HR或NHEJ修復(fù)的細(xì)胞比例，并得知細(xì)胞修復(fù)該位點損傷時在這兩種修復(fù)方式中選擇的偏好性。
接著，研究團(tuán)隊將該報告載體整合至染色質(zhì)不同位點建立了若干不同的細(xì)胞克隆。通過修復(fù)效率分析發(fā)現(xiàn)不同位點的HR效率存在著近72.6倍的巨大差異。進(jìn)一步研究表明，這些位點的核小體密度與HR效率、HR/NHEJ偏好性均存在顯著負(fù)相關(guān)。此外，損傷發(fā)生后，斷裂位點鄰近區(qū)域的核小體密度也顯著降低。這些結(jié)果提示較為松散的染色質(zhì)環(huán)境有利于HR修復(fù)的進(jìn)行。
后續(xù)一系列機(jī)制研究表明：損傷發(fā)生后，多聚ADP核糖聚合酶PARP1催化產(chǎn)生的多聚ADP核糖鏈會通過與去乙酰化酶SIRT1的ZNF結(jié)構(gòu)域及與ATP依賴的染色質(zhì)重塑因子BRG1的ATPase結(jié)構(gòu)域分別發(fā)生相互作用，從而招募其到達(dá)損傷位點。在損傷處，SIRT1對BRG1的1029及1033位賴氨酸進(jìn)行去乙?；瘡亩鰪?qiáng)其ATPase活性，促進(jìn)其松散損傷位點附近的核小體結(jié)構(gòu)，進(jìn)而有利于HR相關(guān)因子RPA2及RAD51招募，最終推動HR修復(fù)的進(jìn)行。
毛志勇教授課題組長期致力于衰老及相關(guān)疾病如腫瘤相關(guān)的DNA損傷修復(fù)的研究工作。本次發(fā)表的研究成果是基于團(tuán)隊前期參與開發(fā)的HR或NHEJ單報告載體進(jìn)行的改進(jìn)與升級，該工具為今后研究者精確研究胞內(nèi)DNA雙鏈斷裂修復(fù)變化及調(diào)控機(jī)制提供了全新的選擇。此外，該工作通過闡述HR修復(fù)過程中PARP1-SIRT1-BRG1信號軸對核小體密度的調(diào)控作用，提示PARP1在HR修復(fù)中亦扮演重要角色，預(yù)示著PARP1抑制劑在HR通路激活的腫瘤類型的治療中也存在潛在的重要應(yīng)用價值。
同濟(jì)大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院博士研究生陳御、張海萍及許柱為本文的共同第一作者。同濟(jì)大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院毛志勇教授、蔣穎副研究員及羅徹斯特大學(xué)Vera Gorbunova教授為本文的共同通訊作者。毛志勇課題組的博士研究生唐歡胤、耿安珂、蔡白蓮、蘇濤，江賜忠教授課題組的史偈君博士及羅徹斯特大學(xué)田驍博士也參與了相關(guān)研究。該工作同時得到了同濟(jì)大學(xué)江賜忠教授、浙江大學(xué)黃俊教授、同濟(jì)大學(xué)附屬第一婦嬰保健院萬小平教授及羅徹斯特大學(xué)Andrei Seluanov教授的支持。該研究成果得到國家重點研發(fā)計劃、優(yōu)秀青年科學(xué)基金、國家自然科學(xué)基金面上項目及上海市優(yōu)秀學(xué)術(shù)帶頭人計劃等經(jīng)費的資助。
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https://academic.oup.com/nar/advance-article/doi/10.1093/nar/gkz592/5530672?searchresult=1
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