Deltorphin B，一種從Phyllomedusa bicolor皮膚中分離出的選擇性δ-阿片受體激動劑。

Deltorphin B, a selective δ-opioid receptor agonist isolated from the skin of Phyllomedusa bicolor.德爾托啡肽是內源性七肽，與已知的任何其他天然化合物相比，它們對δ阿片結合位點具有更高的親和力和選擇性。德爾托芬B（或德爾托芬II）最初是從雙色Phyllomedusa bicolor的皮膚中分離出來的。

Deltorphins are endogenous heptapeptides, that have a higher affinity and selectivity for delta opioid binding sites than any other natural compound known. Deltorphin B (or Deltorphin II) was first isolated from the skin of Phyllomedusa bicolor.

很多蛋白在細胞中非常容易被降解，或被標記，進而被選擇性地破壞。但含有部分D型氨基酸的多肽則顯示了很強的抵抗蛋白酶降解能力。

Definition

Dynorphins are a class of endogenous opioid peptides produced in many different parts of the brain, including the hypothalamus, the hippocampus and the spinal cord, and have many different physiological actions, depending upon the site of production.

Related peptides

Dynorphins arise from the precursor protein prodynorphin. When prodynorphin is cleaved during processing by proprotein convertase 2 (PC2), multiple active peptides are released: dynorphin A, dynorphin B, “big dynorphin” and a/ß-neo-endorphin1.

Discovery

Dynophin was discovered in the mid 1970's in the laboratory of Avram Goldstein, one of the most important researchers in the field of opioid receptors and endogenous opioid peptides. The molecular identification was achieved by Goldstein in collaboration with the Japanese biochemist, Shinro Tachibana for purification, and M. Hunkapiller and L. Hood, who performed the microsequencing.

Structural characteristics

A 4,000-dalton dynorphin (also called the “Big dynorphin”) was isolated from porcine pituitary. It has 32 amino acids, with a heptadecapeptide (17 amino acid sequence), called dynorphin A, at its amino terminus and a related tridecapeptide (13 amino acid sequence), dynorphin B, at its carboxyl terminus. The two peptides are separated by the "processing signal" Lys-Arg2.  

Mechanism of action

Dynorphins primarily exert their effects through a G-protein coupled receptor called the ?-opioid receptor (KOR) 3. Although KOR is the primary receptor for all dynorphins, the peptides do have some affinity for the µ-opioid receptor (MOR), d-opioid receptor (DOR), N-methyl-D-aspartic acid (NMDA)-type glutamate receptor, and bradykinin receptor. Different dynorphins show different receptor selectivities and potencies at receptors. Both big dynorphin and dynorphin A are more potent and more selective than dynorphin B. Dynorphin decreases dopamine release by binding to KORs on dopamine nerve terminals, which leads to drug tolerance and withdrawal symptoms.

 Functions
Dynorphins modulate pain response. They can significantly inhibit morphine- or beta-endorphin-induced analgesia4. Dynorphins inhibit dopamine release that would counter the pleasurable effects of cocaine5.  They are important in maintaining homeostasis through appetite control and circadian rhythms6. In addition to their role in weight control, dynorphins have also been found to regulate body temperature7.

References

1.     Day, R., Lazure, C., Basak, A., Boudreault, A., Limperis, P., Dong, W., et al. (1998). Prodynorphin processing by proprotein convertase 2. Cleavage at single basic residues and enhanced processing in the presence of carboxypeptidase activity. J Biol. Chem., 273(2), 829-836.

2.     W Fischli, A Goldstein, M W Hunkapiller, and L E Hood (1982). Isolation and amino acid sequence   analysis of a 4,000-dalton dynorphin from porcine pituitary. PNAS, 79 (17), 5435-5437.

3.     Nyberg, F. & Hallburg, M. (2007). Neuropeptides in hyperthermia. Progress in brain research,  162:277-93.

4.     FC Tulunay, MF Jen, JK Chang, HH Loh and NM Lee, (1981). Possible regulatory role of dynorphin on morphine- and beta-endorphin- induced analgesia. American Society for Pharmacology and Experimental Therapeutics, 219 (2), 296-298.

5.     Clavin, W. (2005). Dynorphin: Nature’s Own Antidote to Cocaine (and Pleasure?).

6.     Przewlocki, R., Lason, W., Konecka, A. M., Gramsch, C., Herz, A., & Reid, L. D. (1983). The opioid peptide dynorphin, circadian rhythms, and starvation. Science, 219(4580), 71-73.

7.     Xin, L., Geller, E. B., & Adler, M. W. (1997). Body temperature and analgesic effects of selective mu and kappa opioid receptor agonists microdialyzed into rat brain. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, 281(1), 499-507.

定義
神經肽的長度為3-40個氨基酸，可作為神經遞質。它們廣泛分布于中樞神經系統(tǒng)和周圍神經系統(tǒng)。

發(fā)現(xiàn)
神經肽是由約翰·休斯博士和科斯特里茨博士于1975年發(fā)現(xiàn)的。它們是內啡肽，內在產生的嗎啡樣物質，會在體內產生一系列類似藥物的作用。可以從序列信息1中鑒定神經肽前體mRNA序列，并且得到的翻譯蛋白序列包括信號肽序列和一個或多個神經肽。廣泛而復雜的一系列酶處理步驟，包括被激素或前蛋白轉化酶切割以及其他翻譯后修飾，在創(chuàng)建活性神經肽之前就發(fā)生在翻譯后的蛋白質序列上  2,3。

結構特征
通過核磁共振（NMR）光譜研究了幾種來自軟體動物的類似神經肽的構象性質。肽的N末端可變區(qū)中的氨基酸取代對溶液中反向轉化的種群具有顯著影響。通過使用兩個獨立的NMR參數(shù)測得的轉彎數(shù)，發(fā)現(xiàn)使用Helix aspersa的受體膜制劑與IC50值高度相關（r2 = 0.93和0.82）。這些結果表明，構象集合降低了特定肽相對于特定受體4,5的有效濃度。

神經肽Y與人肽相同，并且與禽胰多肽高度同源。神經肽Y和禽胰多肽之間的同源性保留了維持三級結構必不可少的所有殘基。結果表明，神經肽保留了緊湊的三級結構，其特征是在N末端的聚脯氨酸II類螺旋和C末端的a螺旋 6之間廣泛的疏水相互作用。

已經通過許多孤兒受體之一發(fā)現(xiàn)了一些肽，這些受體是內源性配體未知的受體，例如“類阿片受體樣1”（ORL1）。隨后，已闡明該ORL1受體的內源性激動劑的結構，一種稱為孤兒蛋白FQ或傷害感受蛋白的17個氨基酸的肽7。

行動方式
神經肽是由神經元作為細胞間信使釋放的肽。一些神經肽充當神經遞質，而另一些充當激素。神經肽既可以為我們提供支持，也可以為我們提供幫助?？寡咨窠涬目蓭椭覀儨p少皮膚發(fā)炎。神經肽是自然產生的，可以在非常有限的時間內與靶細胞膜受體在明確的作用位點相互作用。因此，大多數(shù)這些內源性化合物的特征在于低的生物屏障滲透性和非常高的酶促降解敏感性。腦室內或全身注射神經肽Y（NPY）可使cast割的雌性大鼠血漿中的促黃體生成激素（LH）水平降低。6。

功能

生物功能，神經肽控制著我們的情緒，能量水平，痛苦和愉悅感，體重以及解決問題的能力；它們還會形成記憶，情感行為，食欲和發(fā)炎，修復疤痕和皺紋并調節(jié)我們的免疫系統(tǒng)。這些活躍的大腦小信使實際上打開了皮膚7的細胞功能。因此，今天，與神經肽系統(tǒng)相互作用的藥物設計是后基因組藥物化學研究最廣泛的途徑之一。

P物質已被確定為負責傷害性信號傳遞的主要神經肽。內源性阿片類藥物是天然神經肽，負責傷害性信號的調節(jié)（通常是抑制）。

免疫系統(tǒng)，當它們被分泌時，它們會激活自然殺傷細胞（NK細胞），從而增強我們的免疫系統(tǒng)。

隨著內啡肽的分泌越來越多，血管病變使收縮的血管恢復到正常狀態(tài)，使血液以正常方式流動。大多數(shù)成人疾病都始于血管堵塞。內啡肽有助于改善血液循環(huán)。

內啡肽通過去除超氧化物具有抗衰老作用。從呼吸進入人體的氧氣可以轉變?yōu)槌趸铩＿@是造成人類疾病和衰老的最大敵人之一。

抗壓力激素，應對壓力的能力與我們體內的內啡肽水平成正比。

緩解疼痛的作用是，我們的神經系統(tǒng)在接收到疼痛信號時會分泌神經遞質。一旦內啡肽在疼痛的那一刻被釋放，內啡肽就會與神經元上的內啡肽受體結合，從而阻止第一種神經遞質被分泌出來。

記憶力，神經肽可以改善記憶力，因為它們可以使腦細胞保持年輕健康。

參考

1.     Hummon AB, Richmond TA, Verleyen P, Baggerman G, Huybrechts J, Ewing MA, Vierstraete E, Rodriguez-Zas SL, Liliane SL, Robinson GE (2006). From the genome to the proteome: uncovering peptides in the Apis brain. Science, 27(314):647-649.

2.     Rockwell NC, Krysan DJ, Komiyama T, Fuller RS (2002). Precursor processing by Kex2/Furin Proteases. Chem. Rev., 102:4525–4548.

3.     Von ER, Beck-Sickinger AG (2004). Biosynthesis of peptide hormones derived from precursor sequences. Curr. Med. Chem.,11:2651–2665.

4.     Edison AS, Espinoza E, Zachariah C (1999). Conformational Ensembles: The Role of Neuropeptide Structures in Receptor Binding. The Journal of Neuroscience., 19(15):6318-6326.

5.     Payza K, Greenberg MJ, Price DA (1989). Further characterization of Helix FMRFamide receptors: kinetics, tissue distribution, and interactions with the endogenous heptapeptides. Peptides, 10:657-661.

6.     Allen J, Novotný J, Martin J, Heinrich G (1987). Molecular structure of mammalian neuropeptide Y: Analysis by molecular cloning and computer-aided comparison with crystal structure of avian homologue. PNAS., 84:2532-2536.

7.     Guya J, Lia S,  Pelletier G (1988). Studies on the physiological role and mechanism of action of neuropeptide Y in the regulation of luteinizing hormone secretion in the rat. Regulatory Peptides., 23(2):209-216.

多肽H2N-Tyr-DAla-Phe-Glu-Val-Val-Gly-NH2的合成步驟：

1、合成MBHA樹脂：取若干克的MBHA樹脂（如初始取代度為0.5mmol/g）和1倍樹脂摩爾量的Fmoc-Linker-OH加入到反應器中，加入DMF，攪拌使氨基酸完全溶解。再加入樹脂2倍量的DIEPA，攪拌混合均勻。再加入樹脂0.95倍量的HBTU，攪拌混合均勻。反應3-4小時后，用DMF洗滌3次。用2倍樹脂體積的10%乙酸酐/DMF 進行封端30分鐘。然后再用DMF洗滌3次，甲醇洗滌2次，DCM洗滌2次，再用甲醇洗滌2次。真空干燥12小時以上，得到干燥的樹脂{Fmoc-Linker-MHBA Resin}，測定取代度。這里測得取代度為 0.3mmol/g。結構如下圖：

2、脫Fmoc：取2.04g的上述樹脂，用DCM或DMF溶脹20分鐘。用DMF洗滌2遍。加3倍樹脂體積的20%Pip/DMF溶液，鼓氮氣30分鐘，然后2倍樹脂體積的DMF 洗滌5次。得到 H2N-Linker-MBHA Resin 。（此步驟脫除Fmoc基團，茚三酮檢測為藍色，Pip為哌啶）。結構圖如下：

3、縮合：取1.84mmol Fmoc-Gly-OH 氨基酸，加入到上述樹脂里，加適當DMF溶解氨基酸，再依次加入3.67mmol DIPEA，1.74mmol HBTU。反應30分鐘后，取小樣洗滌，茚三酮檢測為無色。用2倍樹脂體積的DMF 洗滌3次樹脂。（洗滌樹脂，去掉殘留溶劑，為下一步反應做準備）。得到Fmoc-Gly-Linker-MBHA Resin。氨基酸：DIPEA：HBTU：樹脂=3：6：2.85：1（摩爾比）。結構圖如下：

4、依次循環(huán)步驟二、步驟三，依次得到

H2N-Gly-Linker-MBHA Resin

Fmoc-Val-Gly-Linker-MBHA Resin

H2N-Val-Gly-Linker-MBHA Resin

Fmoc-Val-Val-Gly-Linker-MBHA Resin

H2N-Val-Val-Gly-Linker-MBHA Resin

Fmoc-Glu(OtBu)-Val-Val-Gly-Linker-MBHA Resin

H2N-Glu(OtBu)-Val-Val-Gly-Linker-MBHA Resin

Fmoc-Phe-Glu(OtBu)-Val-Val-Gly-Linker-MBHA Resin

H2N-Phe-Glu(OtBu)-Val-Val-Gly-Linker-MBHA Resin

Fmoc-DAla-Phe-Glu(OtBu)-Val-Val-Gly-Linker-MBHA Resin

H2N-DAla-Phe-Glu(OtBu)-Val-Val-Gly-Linker-MBHA Resin

Fmoc-Tyr(tBu)-DAla-Phe-Glu(OtBu)-Val-Val-Gly-Linker-MBHA Resin

以上中間結構，均可在專肽生物多肽計算器-多肽結構計算器中，一鍵畫出。

最后再經過步驟二得到 H2N-Tyr(tBu)-DAla-Phe-Glu(OtBu)-Val-Val-Gly-Linker-MBHA Resin，結構如下：

5、切割：6倍樹脂體積的切割液（或每1g樹脂加8ml左右的切割液），搖床搖晃 2小時，過濾掉樹脂，用冰無水乙醚沉淀濾液，并用冰無水乙醚洗滌沉淀物3次，最后將沉淀物放真空干燥釜中，常溫干燥24小試，得到粗品H2N-Tyr-DAla-Phe-Glu-Val-Val-Gly-NH2。結構圖見產品結構圖。

切割液選擇：1）TFA：H2O=95%：5%

2）TFA：H2O：TIS=95%：2.5%：2.5%

3）三氟乙酸：茴香硫醚：1，2-乙二硫醇：苯酚：水=87.5%：5%：2.5%：2.5%：2.5%

（前兩種適合沒有容易氧化的氨基酸，例如Trp、Cys、Met。第三種適合幾乎所有的序列。）

6、純化凍干：使用液相色譜純化，收集目標峰液體，進行凍干，獲得蓬松的粉末狀固體多肽。不過這時要取小樣復測下純度 是否目標純度。

7、最后總結：

杭州專肽生物技術有限公司（ALLPEPTIDE http://www.cqhongyadong.com.cn）主營定制多肽合成業(yè)務，提供各類長肽，短肽，環(huán)肽，提供各類修飾肽，如：熒光標記修飾（CY3、CY5、CY5.5、CY7、FAM、FITC、Rhodamine B、TAMRA等），功能基團修飾肽（疊氮、炔基、DBCO、DOTA、NOTA等），同位素標記肽（N15、C13），訂書肽（Stapled Peptide）,脂肪酸修飾肽（Pal、Myr、Ste），磷酸化修飾肽（P-Ser、P-Thr、P-Tyr），環(huán)肽（酰胺鍵環(huán)肽、一對或者多對二硫鍵環(huán)），生物素標記肽，PEG修飾肽，甲基化修飾肽

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