The fluorogenic substrate Z-IETD-AFC corresponds to one of the cleavage sites of the inactive 32 kD caspase-3 precursor (amino acids 172-175). Substrate for granzyme B.

多肽熒光標記由于沒有放射性，實驗操作簡單。因此，目前在生物學研究中多肽熒光標記應用非常廣泛，多肽熒光標記方法與熒光試劑的結構有關系，對于有游離羧基的采用的方法與接多肽反應相同，也采用HBTU/HOBt/DIEA方法連接。 在N端標記FITC的多肽需經(jīng)歷環(huán)化作用來形成熒光素，通常會伴有最后一個氨基酸的去除，但當有一個間隔器如氨基己酸，或者是通過非酸性環(huán)境將目的多肽從樹脂上切下來時，這種情況可避免在切割的過程中被TFA切割掉。
        人們利用利用熒光標記的多肽來檢測目標蛋白的活性，并將 其發(fā)展的高通量活性篩選方法應用于疾病治療靶點蛋白的藥物篩選和藥物開發(fā)（例如，各種激 酶、磷酸酶、肽酶等）。
        專肽生物能夠提供技術成熟的各種熒光標記多肽。
 

下面是一些常見的多肽修飾熒光物質結構：




FITC標記

      FITC(異硫氰酸熒光素)具有比較高的活性，我們公司可以通過兩種方式將FITC標記于多肽 上：(1) 將FITC標記于賴氨酸（Lys）或被選擇性地脫保護的鳥氨酸（ornithine）側鏈氨基 上；(2) 將FITC標記于多肽N端氨基。

      當在N端標記時，建議在最后一個氨基和由異硫氰酸酯與氨基反應產(chǎn)生的硫脲鍵之間引入 烷基間隔器（alkyl spacer），如氨基己酸（Ahx）。鏈接切割需要酸性環(huán)境，在N端標記FITC 的多肽需經(jīng)歷環(huán)化作用來形成熒光素，通常會伴有最后一個氨基酸的去除，但當有一個間隔器 如氨基己酸，或者是通過非酸性環(huán)境將目的肽從樹脂上切下來時，這種情況可避免?？臻g位阻 被認為是在熒光染料前使用Ahx的主要原因，而不是為什么FITC不能直接偶聯(lián)在多肽上的原因。

      Ahx或b-Ala均可作為間隔器用于FITC標記的多肽上。

普通熒光修飾

通過Lys側鏈氨基連接的熒光修飾

專肽常做的熒光物質的激發(fā)光波長和發(fā)射光波長?？晒﹨⒖歼x擇：

定義
細胞凋亡或程序性細胞死亡是多細胞生物發(fā)育和健康的正常組成部分。細胞響應各種刺激而死亡，在細胞凋亡期間，它們以受控，受控的方式死亡。

發(fā)現(xiàn)
1885年， Flemming W描述了程序性細胞死亡的過程。約翰·克爾（John Kerr）在1960年代后期的發(fā)現(xiàn)最初被稱為“收縮壞死”，但后來改名為“細胞凋亡”，是在他對大鼠急性肝損傷的研究中，他的注意力被好奇的肝細胞死亡形式引起的 ^1,2。  1972年，Kerr提出了術語“細胞凋亡”的意思是控制細胞缺失的機制，它似乎在調節(jié)動物細胞群中與有絲分裂起著互補但相反的作用。它的形態(tài)學特征表明它是一種活躍的，固有編程的現(xiàn)象，并且已經(jīng)表明它可以被多種環(huán)境刺激所引發(fā)或抑制， ³。 

結構特征
Bcl-2家族成員之間的異二聚化是調節(jié)程序性細胞死亡的關鍵事件。通過確定存活蛋白Bcl-xL和Bcl-2相關蛋白Bak的促死亡區(qū)域之間的復合物的溶液結構，研究了異二聚體形成的分子基礎。突變型Bak肽的結構和結合親和力表明Bak肽采用兩親性螺旋，通過疏水和靜電相互作用與Bcl-xL相互作用。全長Bak的突變會破壞任一類型的相互作用，從而抑制Bak與Bcl-xL ⁴異源二聚的能力。

通過核磁共振波譜（NMR）確定與Bcl-xL具有生物活性的缺失突變體復合的16-氨基酸肽的結構。由總共2813個NMR約束確定結構，并通過NMR數(shù)據(jù)很好地定義了結構。當與Bcl-xL復合時，Bak肽形成螺旋。Bak肽的COOH末端部分主要與BH2和BH3區(qū)的殘基相互作用。黑色素瘤細胞凋亡抑制劑（ML-IAP）是一種有效的抗凋亡蛋白，在許多黑色素瘤細胞系中上調，但在大多數(shù)正常成人組織中均未表達。在人類癌癥中，IAP蛋白（例如ML-IAP或普遍表達的X染色體連接的IAP（XIAP））的過表達已顯示可抑制多種刺激誘導的細胞凋亡。⁵。

作用方式
一旦收到指示細胞進行凋亡的特定信號，細胞中就會發(fā)生許多明顯的變化。稱為胱天蛋白酶的蛋白質家族通常在凋亡的早期被激活。這些蛋白質分解或切割正常細胞功能所需的關鍵細胞成分，包括細胞骨架中的結構蛋白和核蛋白（例如DNA修復酶）。半胱天冬酶還可以活化其他降解酶，例如DNase，其開始切割細胞核中的DNA。

凋亡細胞在凋亡過程中表現(xiàn)出獨特的形態(tài)。通常，在細胞骨架中的lamins和肌動蛋白絲分裂后，細胞開始收縮。染色質在細胞核中的分解通常會導致核濃縮，并且在許多情況下，凋亡細胞的細胞核呈“馬蹄形”的外觀。細胞繼續(xù)收縮，將自身包裝成可被巨噬細胞去除的形式。有許多機制可以通過誘導細胞凋亡。細胞對這些刺激中任何一種的敏感性可能會因多種因素而異，例如促凋亡和抗凋亡蛋白（例如Bcl-2蛋白或凋亡蛋白的抑制劑）的表達，刺激的嚴重程度和細胞周期的階段。Bcl-2蛋白家族在調節(jié)多種刺激誘導的凋亡細胞死亡中起著核心作用。該家族中的某些蛋白質，包括Bcl-2和Bcl-xL，可以抑制程序性細胞死亡，而其他蛋白質，例如Bax和Bak，可以促進細胞凋亡 ^6、7。

功能

對于發(fā)育，細胞凋亡與有絲分裂一樣是正常發(fā)育所必需的。例子：tail變尾時into的吸收被青蛙吸收。

生物體的完整性需要凋亡來破壞對生物體完整性構成威脅的細胞。例子：感染了病毒的細胞⁸。

免疫系統(tǒng)的細胞，一種細胞介導的免疫反應減弱，必須去除效應細胞以防止它們攻擊機體成分。CTLs互相誘導凋亡，甚至自身誘導凋亡⁹。

具有DNA損傷，破壞其基因組的細胞會導致細胞破壞正常的胚胎發(fā)育，導致先天缺陷變成癌。

參考

1.     Kerr JF (1965). A histochemical study of hypertrophy and ischaemic injury of rat liver with special reference to changes in lysosomes. Journal of Pathology and Bacteriology, 90(90):419-435.

2.     Kerr JF, Wyllie AH, Currie AR (1972). Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics. Br. J. Cancer., 26(4):239-257.

3.     O'Rourke MG, Ellem KA (2000). John Kerr and apoptosis. Med. J. Aust., 173(11-12): 616-617.

4.     Franklin MC, Kadkhodayan S, Ackerly H, Alexandru D, Distefano MD, Elliott LO, Flygare JA, Mausisa G, Okawa DC, Ong D, Vucic D, Deshayes K, Fairbrother WJ (2003). Structure and function analysis of peptide antagonists of melanoma inhibitor of apoptosis (ML-IAP). Biochemistry, 42(27):8223-8231.

5.     Sattler M, Liang H, Nettesheim D, Meadows RP, Harlan JE, Eberstadt M, Yoon HS, Shuker SB, Chang BS, Minn AJ, Thompson CB, Fesik SW (1997). Structure of bcl-xl-bak peptide complex: recognition between regulators of apoptosis. Science, 275(5302):983-986.

6.     Hanada M, Aimé-Sempé C, Sato T, Reed JC (1995). Structure-function analysis of Bcl-2 protein. Identification of conserved domains important for homodimerization with Bcl-2 and heterodimerization with Bax. J. Biol. Chem., 270(20):11962-11969.

7.     Cheng EHY, Levine B, Boise LH, Thompson CB, Hardwic JM (1996). Bax-independent inhibition of apoptosis by Bcl-xL.Nature, 379:554-556.

8.     Alimonti JB, Ball TB, Fowke KR (2003). Mechanisms of CD4+ T lymphocyte cell death in human immunodeficiency virus infection and AIDS. J Gen Virology., 84(84): 1649-1661.

9.     Werlen G, Hausmann B, Naeher D, Palmer E (2003). Signaling life and death in the thymus: timing is everything. Science. 299(5614):1859-1863.

多肽Cbz-Ile-Glu-Thr-Asp-AFC的合成步驟：

1、合成CTC樹脂：稱取2.56g CTC Resin（如初始取代度約為0.82mmol/g）和2.52mmol Fmoc-Asp(OtBu)-OH于反應器中，加入適量DCM溶解氨基酸（需要注意，此時CTC樹脂體積會增大好幾倍，避免DCM溶液過少），再加入6.3mmol DIPEA（Mw：129.1,d：0.740g/ml），反應2-3小時后，可不抽濾溶液，直接加入1ml的HPLC級甲醇，封端半小時。依次用DMF洗滌2次，甲醇洗滌1次，DCM洗滌一次，甲醇洗滌一次，DCM洗滌一次，DMF洗滌2次（這里使用甲醇和DCM交替洗滌，是為了更好地去除其他溶質，有利于后續(xù)反應）。得到  Fmoc-Asp(OtBu)-CTC Resin。結構圖如下：

2、脫Fmoc：加3倍樹脂體積的20%Pip/DMF溶液，鼓氮氣30分鐘，然后2倍樹脂體積的DMF 洗滌5次。得到 H2N-Asp(OtBu)-CTC Resin 。（此步驟脫除Fmoc基團，茚三酮檢測為藍色，Pip為哌啶）。結構圖如下：

3、縮合：取6.3mmol Fmoc-Thr(tBu)-OH 氨基酸，加入到上述樹脂里，加適當DMF溶解氨基酸，再依次加入12.6mmol DIPEA，5.98mmol HBTU。反應30分鐘后，取小樣洗滌，茚三酮檢測為無色。用2倍樹脂體積的DMF 洗滌3次樹脂。（洗滌樹脂，去掉殘留溶劑，為下一步反應做準備）。得到Fmoc-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-CTC Resin。氨基酸：DIPEA：HBTU：樹脂=3：6：2.85：1（摩爾比）。結構圖如下：

4、依次循環(huán)步驟二、步驟三，依次得到

H2N-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-CTC Resin

Fmoc-Glu(OtBu)-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-CTC Resin

H2N-Glu(OtBu)-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-CTC Resin

Fmoc-Ile-Glu(OtBu)-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-CTC Resin

以上中間結構，均可在專肽生物多肽計算器-多肽結構計算器中，一鍵畫出。

最后再經(jīng)過步驟二得到 H2N-Ile-Glu(OtBu)-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-CTC Resin，結構如下：

5、苯甲氧羰酰琥珀酰亞胺Cbz-Cl反應連接：在上述樹脂中，加入適當DMF后，再加入6.3mmol 苯甲氧羰酰琥珀酰亞胺Cbz-Cl到樹脂中，再加入12.6mmol DIPEA、5.98mmol HBTU，鼓氮氣反應30分鐘。用2倍樹脂體積的DMF 洗滌3次樹脂（洗滌樹脂，去掉殘留溶劑，為下一步反應做準備）。 得到Cbz-Ile-Glu(OtBu)-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-CTC Resin。 結構如下：

6、全保護切割：配置0.5%TFA/DCM溶液，溶液體積約為樹脂體積的3倍。再次用DCM洗滌樹脂2遍（去除殘留DMF），后將配置好的溶液倒入到反應器中，反應30分鐘。抽濾樹脂，收集濾液（此時多肽已經(jīng)從樹脂上分離，存在于濾液中）。多肽序列為 Cbz-Ile-Glu(OtBu)-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-CTC Resin。 在濾液中添加DIEPA，調PH至7-8。用飽和NaHCO3洗滌濾液，分離出DCM層溶液?？蛇m當旋蒸DCM層溶液，減少有機溶劑。再次加入1或2倍體積的乙酸乙酯，用稀HCl溶液調PH至微酸性，將多肽從DCM層萃取到乙酸乙酯層。用飽和NaCl洗滌2次乙酸乙酯層。用無水硫酸鎂吸收乙酸乙酯層的水分。通過減壓旋蒸，直接將乙酸乙酯完全旋蒸掉，得到晶體狀固體多肽，用于下一步C端反應?；蛲ㄟ^減壓旋蒸保留適量乙酸乙酯的溶液體積，加入冰乙醚析出 多肽，然后對多肽進行烘干操作即可用于下一步C端反應。Cbz-Ile-Glu(OtBu)-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-COOH的結構圖如下。

7、7-氨基-4-三氟甲基香豆素反應連接：在上述樹脂中，加入適當DMF后，再加入6.3mmol 7-氨基-4-三氟甲基香豆素到樹脂中，再加入12.6mmol DIPEA、5.98mmol HBTU，鼓氮氣反應30分鐘。用2倍樹脂體積的DMF 洗滌3次樹脂（洗滌樹脂，去掉殘留溶劑，為下一步反應做準備）。 得到 Cbz-Ile-Glu(OtBu)-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-AFC。 結構如下：

8、切割：6倍樹脂體積的切割液（或每1g樹脂加8ml左右的切割液），搖床搖晃 2小時，過濾掉樹脂，用冰無水乙醚沉淀濾液，并用冰無水乙醚洗滌沉淀物3次，最后將沉淀物放真空干燥釜中，常溫干燥24小試，得到粗品Cbz-Ile-Glu-Thr-Asp-AFC。結構圖見產(chǎn)品結構圖。

切割液選擇：1）TFA：H2O=95%：5%

2）TFA：H2O：TIS=95%：2.5%：2.5%

3）三氟乙酸：茴香硫醚：1，2-乙二硫醇：苯酚：水=87.5%：5%：2.5%：2.5%：2.5%

（前兩種適合沒有容易氧化的氨基酸，例如Trp、Cys、Met。第三種適合幾乎所有的序列。）

9、純化凍干：使用液相色譜純化，收集目標峰液體，進行凍干，獲得蓬松的粉末狀固體多肽。不過這時要取小樣復測下純度 是否目標純度。

10、最后總結：

杭州專肽生物技術有限公司（ALLPEPTIDE http://www.cqhongyadong.com.cn）主營定制多肽合成業(yè)務，提供各類長肽，短肽，環(huán)肽，提供各類修飾肽，如：熒光標記修飾（CY3、CY5、CY5.5、CY7、FAM、FITC、Rhodamine B、TAMRA等），功能基團修飾肽（疊氮、炔基、DBCO、DOTA、NOTA等），同位素標記肽（N15、C13），訂書肽（Stapled Peptide）,脂肪酸修飾肽（Pal、Myr、Ste），磷酸化修飾肽（P-Ser、P-Thr、P-Tyr），環(huán)肽（酰胺鍵環(huán)肽、一對或者多對二硫鍵環(huán)），生物素標記肽，PEG修飾肽，甲基化修飾肽等。

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