多肽熒光標記由于沒有放射性，實驗操作簡單。因此，目前在生物學研究中多肽熒光標記應用非常廣泛，多肽熒光標記方法與熒光試劑的結構有關系，對于有游離羧基的采用的方法與接多肽反應相同，也采用HBTU/HOBt/DIEA方法連接。 在N端標記FITC的多肽需經歷環(huán)化作用來形成熒光素，通常會伴有最后一個氨基酸的去除，但當有一個間隔器如氨基己酸，或者是通過非酸性環(huán)境將目的多肽從樹脂上切下來時，這種情況可避免在切割的過程中被TFA切割掉。
        人們利用利用熒光標記的多肽來檢測目標蛋白的活性，并將 其發(fā)展的高通量活性篩選方法應用于疾病治療靶點蛋白的藥物篩選和藥物開發(fā)（例如，各種激 酶、磷酸酶、肽酶等）。
        專肽生物能夠提供技術成熟的各種熒光標記多肽。
 

下面是一些常見的多肽修飾熒光物質結構：




FITC標記
 

      FITC(異硫氰酸熒光素)具有比較高的活性，我們公司可以通過兩種方式將FITC標記于多肽 上：(1) 將FITC標記于賴氨酸（Lys）或被選擇性地脫保護的鳥氨酸（ornithine）側鏈氨基 上；(2) 將FITC標記于多肽N端氨基。

      當在N端標記時，建議在最后一個氨基和由異硫氰酸酯與氨基反應產生的硫脲鍵之間引入 烷基間隔器（alkyl spacer），如氨基己酸（Ahx）。鏈接切割需要酸性環(huán)境，在N端標記FITC 的多肽需經歷環(huán)化作用來形成熒光素，通常會伴有最后一個氨基酸的去除，但當有一個間隔器 如氨基己酸，或者是通過非酸性環(huán)境將目的肽從樹脂上切下來時，這種情況可避免?？臻g位阻 被認為是在熒光染料前使用Ahx的主要原因，而不是為什么FITC不能直接偶聯(lián)在多肽上的原因。

      Ahx或b-Ala均可作為間隔器用于FITC標記的多肽上。

普通熒光修飾

通過Lys側鏈氨基連接的熒光修飾

專肽常做的熒光物質的激發(fā)光波長和發(fā)射光波長?？晒﹨⒖歼x擇：
 

Substrate for dengue virus NS2B-NS3 and yellow fever virus NS3 protease. The kcat/Km value of Bz-NleKRR-AMC for the dengue virus type 4 (DEN4) enzyme is > 800 fold higher than that of Boc-Gly-Arg-Arg-AMC, a widely used NS3 substrate (kcat = 2.9 s?¹, Km = 8.6 μM for DEN4). For yellow fever virus NS3 protease the kcat value was 0.111 s?¹, the Km value 14.6 μM.

多肽Benzoyl-Nle-Lys-Arg-Arg-AMC的合成步驟：

1、合成CTC樹脂：稱取1.53g CTC Resin（如初始取代度約為0.96mmol/g）和1.76mmol Fmoc-Arg(Pbf)-OH于反應器中，加入適量DCM溶解氨基酸（需要注意，此時CTC樹脂體積會增大好幾倍，避免DCM溶液過少），再加入4.41mmol DIPEA（Mw：129.1,d：0.740g/ml），反應2-3小時后，可不抽濾溶液，直接加入1ml的HPLC級甲醇，封端半小時。依次用DMF洗滌2次，甲醇洗滌1次，DCM洗滌一次，甲醇洗滌一次，DCM洗滌一次，DMF洗滌2次（這里使用甲醇和DCM交替洗滌，是為了更好地去除其他溶質，有利于后續(xù)反應）。得到  Fmoc-Arg(Pbf)-CTC Resin。結構圖如下：

2、脫Fmoc：加3倍樹脂體積的20%Pip/DMF溶液，鼓氮氣30分鐘，然后2倍樹脂體積的DMF 洗滌5次。得到 H2N-Arg(Pbf)-CTC Resin 。（此步驟脫除Fmoc基團，茚三酮檢測為藍色，Pip為哌啶）。結構圖如下：

3、縮合：取4.41mmol Fmoc-Arg(Pbf)-OH 氨基酸，加入到上述樹脂里，加適當DMF溶解氨基酸，再依次加入8.81mmol DIPEA，4.19mmol HBTU。反應30分鐘后，取小樣洗滌，茚三酮檢測為無色。用2倍樹脂體積的DMF 洗滌3次樹脂。（洗滌樹脂，去掉殘留溶劑，為下一步反應做準備）。得到Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-CTC Resin。氨基酸：DIPEA：HBTU：樹脂=3：6：2.85：1（摩爾比）。結構圖如下：

4、依次循環(huán)步驟二、步驟三，依次得到

H2N-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-CTC Resin

Fmoc-Lys(Boc)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-CTC Resin

H2N-Lys(Boc)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-CTC Resin

Fmoc-Nle-Lys(Boc)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-CTC Resin

以上中間結構，均可在專肽生物多肽計算器-多肽結構計算器中，一鍵畫出。

最后再經過步驟二得到 H2N-Nle-Lys(Boc)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-CTC Resin，結構如下：

5、苯甲酸反應連接：在上述樹脂中，加入適當DMF后，再加入4.41mmol苯甲酸到樹脂中，再加入8.81mmol DIPEA，鼓氮氣反應30分鐘。用2倍樹脂體積的DMF 洗滌3次樹脂（洗滌樹脂，去掉殘留溶劑，為下一步反應做準備）。 得到Benzoyl-Nle-Lys(Boc)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-CTC Resin。 結構如下：

6、全保護切割：配置0.5%TFA/DCM溶液，溶液體積約為樹脂體積的3倍。再次用DCM洗滌樹脂2遍（去除殘留DMF），后將配置好的溶液倒入到反應器中，反應30分鐘。抽濾樹脂，收集濾液（此時多肽已經從樹脂上分離，存在于濾液中）。多肽序列為 Benzoyl-Nle-Lys(Boc)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-CTC Resin。 在濾液中添加DIEPA，調PH至7-8。用飽和NaHCO3洗滌濾液，分離出DCM層溶液。可適當旋蒸DCM層溶液，減少有機溶劑。再次加入1或2倍體積的乙酸乙酯，用稀HCl溶液調PH至微酸性，將多肽從DCM層萃取到乙酸乙酯層。用飽和NaCl洗滌2次乙酸乙酯層。用無水硫酸鎂吸收乙酸乙酯層的水分。通過減壓旋蒸，直接將乙酸乙酯完全旋蒸掉，得到晶體狀固體多肽，用于下一步C端反應。或通過減壓旋蒸保留適量乙酸乙酯的溶液體積，加入冰乙醚析出 多肽，然后對多肽進行烘干操作即可用于下一步C端反應。Benzoyl-Nle-Lys(Boc)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-COOH的結構圖如下。

7、7-氨基-4-甲基香豆素反應連接：在上述樹脂中，加入適當DMF后，再加入4.41mmol 7-氨基-4-甲基香豆素到樹脂中，再加入8.81mmol DIPEA、4.19mmol HBTU，鼓氮氣反應30分鐘。用2倍樹脂體積的DMF 洗滌3次樹脂（洗滌樹脂，去掉殘留溶劑，為下一步反應做準備）。 得到 Benzoyl-Nle-Lys(Boc)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-AMC。 結構如下：

8、切割：6倍樹脂體積的切割液（或每1g樹脂加8ml左右的切割液），搖床搖晃 2小時，過濾掉樹脂，用冰無水乙醚沉淀濾液，并用冰無水乙醚洗滌沉淀物3次，最后將沉淀物放真空干燥釜中，常溫干燥24小試，得到粗品Benzoyl-Nle-Lys-Arg-Arg-AMC。結構圖見產品結構圖。

切割液選擇：1）TFA：H2O=95%：5%

2）TFA：H2O：TIS=95%：2.5%：2.5%

3）三氟乙酸：茴香硫醚：1，2-乙二硫醇：苯酚：水=87.5%：5%：2.5%：2.5%：2.5%

（前兩種適合沒有容易氧化的氨基酸，例如Trp、Cys、Met。第三種適合幾乎所有的序列。）

9、純化凍干：使用液相色譜純化，收集目標峰液體，進行凍干，獲得蓬松的粉末狀固體多肽。不過這時要取小樣復測下純度 是否目標純度。

10、最后總結：

杭州專肽生物技術有限公司（ALLPEPTIDE http://www.cqhongyadong.com.cn）主營定制多肽合成業(yè)務，提供各類長肽，短肽，環(huán)肽，提供各類修飾肽，如：熒光標記修飾（CY3、CY5、CY5.5、CY7、FAM、FITC、Rhodamine B、TAMRA等），功能基團修飾肽（疊氮、炔基、DBCO、DOTA、NOTA等），同位素標記肽（N15、C13），訂書肽（Stapled Peptide）,脂肪酸修飾肽（Pal、Myr、Ste），磷酸化修飾肽（P-Ser、P-Thr、P-Tyr），環(huán)肽（酰胺鍵環(huán)肽、一對或者多對二硫鍵環(huán)），生物素標記肽，PEG修飾肽，甲基化修飾肽

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