多肽的合成主要分為兩條途徑:化學(xué)合成多肽和生物合成多肽。

化學(xué)合成主要是以氨基酸與氨基酸之間縮合的形式來(lái)進(jìn)行。在合成含有特定順序的多肽時(shí)，由于多肽合成原料中含有官能度大于2的氨基酸單體，多肽合成時(shí)應(yīng)將不需要反應(yīng)的基團(tuán)暫時(shí)保護(hù)起來(lái)，方可進(jìn)行成肽反應(yīng)，這樣保證了多肽合成目標(biāo)產(chǎn)物的定向性。多肽的化學(xué)合成又分為液相合成和固相合成。

多肽液相合成主要分為逐步合成和片段組合兩種策略。逐步合成簡(jiǎn)潔迅速，可用于各種生物活性多肽片段的合成。片段組合法主要包括天然化學(xué)連接和施陶丁格連接。近年，多肽液相片段合成法發(fā)展迅速，在多肽和蛋白質(zhì)合成領(lǐng)域已取得了重大突破。在多肽片段合成法中，根據(jù)多肽片段的化學(xué)特定性或化學(xué)選擇性，多肽片段能夠自發(fā)進(jìn)行連接，得到目標(biāo)多肽。因?yàn)槎嚯钠魏械陌被釟埢鄬?duì)較少，所以純度較高，且易于純化。

多肽的生物合成方法主要包括發(fā)酵法、酶解法，隨著生物工程技術(shù)的發(fā)展，以DNA重組技術(shù)為主導(dǎo)的基因工程法也被應(yīng)用于多肽的合成。

多肽的固相合成

多肽的合成是氨基酸重復(fù)添加的過程，通常從C端向N端(氨基端)進(jìn)行合成。多肽固相合成的原理是將目的肽的第一個(gè)氨基酸C端通過共價(jià)鍵與固相載體連接，再以該氨基酸N端為合成起點(diǎn)，經(jīng)過脫去氨基保護(hù)基和過量的已活化的第二個(gè)氨基酸進(jìn)行反應(yīng)，接長(zhǎng)肽鏈，重復(fù)操作，達(dá)到理想的合成肽鏈長(zhǎng)度，最后將肽鏈從樹脂上裂解下來(lái)，分離純化，獲得目標(biāo)多肽。

1、Boc多肽合成法

Boc方法是經(jīng)典的多肽固相合成法，以Boc作為氨基酸α-氨基的保護(hù)基，芐醇類作為側(cè)鏈保護(hù)基，Boc的脫除通常采用三氟乙酸(TFA)進(jìn)行。多肽合成時(shí)將已用Boc保護(hù)好的N-α-氨基酸共價(jià)交聯(lián)到樹脂上，TFA切除Boc保護(hù)基，N端用弱堿中和。

肽鏈的延長(zhǎng)通過二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)活化、偶聯(lián)進(jìn)行，最終采用強(qiáng)酸氫氟酸(HF)法或三氟甲磺酸(TFMSA)將合成的目標(biāo)多肽從樹脂上解離。在Boc多肽合成法中，為了便于下一步的多肽合成，反復(fù)用酸進(jìn)行脫保護(hù)，一些副反應(yīng)被帶入實(shí)驗(yàn)中，例如多肽容易從樹脂上切除下來(lái)，氨基酸側(cè)鏈在酸性條件不穩(wěn)定等。

2、Fmoc多肽合成法

Carpino和Han以Boc多肽合成法為基礎(chǔ)發(fā)展起來(lái)一種多肽固相合成的新方法——Fmoc多肽合成法。

Fmoc多肽合成法以Fmoc作為氨基酸α-氨基的保護(hù)基。其優(yōu)勢(shì)為在酸性條件下是穩(wěn)定的，不受TFA等試劑的影響，應(yīng)用溫和的堿處理可脫保護(hù)，所以側(cè)鏈可用易于酸脫除的Boc保護(hù)基進(jìn)行保護(hù)。

肽段的最后切除可采用TFA/二氯甲烷(DCM)從樹脂上定量完成，避免了采用強(qiáng)酸。同時(shí)，與Boc法相比，F(xiàn)moc法反應(yīng)條件溫和，副反應(yīng)少，產(chǎn)率高，并且Fmoc基團(tuán)本身具有特征性紫外吸收，易于監(jiān)測(cè)控制反應(yīng)的進(jìn)行。Fmoc法在多肽固相合成領(lǐng)域應(yīng)用越來(lái)越廣泛。

多肽液相分段合成

隨著多肽合成的發(fā)展，多肽液相分段合成(即多肽片段在溶液中依據(jù)其化學(xué)專一性或化學(xué)選擇性，自發(fā)連接成長(zhǎng)肽的合成方法)在多肽合成領(lǐng)域中的作用越來(lái)越突出。其特點(diǎn)在于可以用于長(zhǎng)肽的合成，并且純度高，易于純化。

多肽液相分段合成主要分為天然化學(xué)連接和施陶丁格連接。天然化學(xué)連接是多肽分段合成的基礎(chǔ)方法，局限在于所合成的多肽必須含半光氨酸(Cys)殘基，因而限定了天然化學(xué)連接方法的應(yīng)用范圍。天然化學(xué)連接方法的延伸包括化學(xué)區(qū)域選擇連接、可除去輔助基連接、光敏感輔助基連接。

施陶丁格連接方法是另一種基礎(chǔ)的片段連接方法，其為多肽片段連接途徑開拓了更廣闊的思路。正交化學(xué)連接方法是施陶丁格連接方法的延伸，通過簡(jiǎn)化膦硫酯輔助基來(lái)提高片段間的縮合率。

其他多肽合成方法

1、氨基酸的羧內(nèi)酸酐法(NCA)

氨基酸的羧內(nèi)酸酐的氨基保護(hù)基也可活化羧基。

NCA的原理:在堿性條件下，氨基酸陰離子與NCA形成一個(gè)更穩(wěn)定的氨基甲酸酯類離子，在酸化時(shí)該離子失去二氧化碳，生成二肽。生成的二肽又與其他的NCA結(jié)合，反復(fù)進(jìn)行。

NCA適用于短鏈肽片段的多肽合成，其周期短、操作簡(jiǎn)單、成本低、得到產(chǎn)物分子量高，在目前多肽合成中所占比例較大，技術(shù)也較為通用。

2、組合化學(xué)法

20世紀(jì)80年代，以固相多肽合成為基礎(chǔ)提出了組合化學(xué)法，即氨基酸的構(gòu)建單元通過組合的方式進(jìn)行連接，合成出含有大量化合物的化學(xué)庫(kù)，并從中篩選出具有某種理化性質(zhì)或藥理活性化合物的一套多肽合成策略和篩選方案。

組合化學(xué)法的多肽合成策略主要包括:混合-均分法、迭代法、光控定位組合庫(kù)法、茶葉袋法等。組合化學(xué)法的最大優(yōu)點(diǎn)在于可同時(shí)合成多種化合物，并且能最大限度地篩選各種新化合物及其異構(gòu)體。

3、酶解法

酶解法是用生物酶降解植物蛋白質(zhì)和動(dòng)物蛋白質(zhì)，獲得小分子多肽。酶解法因其多肽產(chǎn)量低、投資大、周期長(zhǎng)、污染嚴(yán)重，未能實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。酶解法獲得的多肽能夠保留蛋白質(zhì)原有的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，并且可以獲得比原蛋白質(zhì)更多的功能，更加綠色，更加健康。

4、基因工程法

基因工程法主要以DNA重組技術(shù)為基礎(chǔ)，通過合適的DNA模板來(lái)控制多肽的序列合成。有研究者通過基因工程法獲得了準(zhǔn)彈性蛋白-聚纈氨酸-脯氨酸-甘氨酸-纈氨酸-甘氨酸肽(VPGVG)。

利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)的活性多肽還有肽類抗生素、干擾素類、白介素類、生長(zhǎng)因子類、腫瘤壞死因子、人生長(zhǎng)激素，血液中凝血因子、促紅細(xì)胞生成素，組織非蛋白纖溶酶原等。

基因工程法合成多肽具有表達(dá)定向性強(qiáng)，安全衛(wèi)生，原料來(lái)源廣泛和成本低等優(yōu)點(diǎn)，但因存在高效表達(dá)，不易分離，產(chǎn)率低的問題，難以實(shí)現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)。

5、發(fā)酵法

發(fā)酵法是從微生物代謝產(chǎn)物中獲得多肽的方法。雖然發(fā)酵法的成本低，但其應(yīng)用范圍較窄，因?yàn)楝F(xiàn)在微生物能夠獨(dú)立合成的聚氨基酸只有ε-聚賴氨酸(ε-PL)、γ-聚谷氨酸(γ-PGA)和藍(lán)細(xì)菌肽。

多肽產(chǎn)物純度選擇

常見的質(zhì)譜級(jí)多肽純度，一般要求>95%

用于抗體篩選純度，一般>85%即可

NMR和結(jié)晶試驗(yàn)中，純度一般>98%

粗品肽，一般>50%即可用于多肽篩選

參與文獻(xiàn)