摘要:

生物大分子在許多疾病的治療中發(fā)揮著重要的作用, 但由于細胞膜的天然屏障作用, 只有分子質量小于600 Da 的分子才能穿透細胞膜進入細胞內。這使得一些有治療價值但無細胞膜穿透性的分子在細胞生物學、藥學等領域的應用受到極大的限制。近年來發(fā)現(xiàn)的一些具有細胞穿透功能的短肽 (少于 30 個氨基酸) 即細胞穿膜肽 (CPPs), 能夠有效地將蛋白質、多肽、核酸片段等以多種方式導入多種哺乳動物細胞, 其轉導效率高且不會造成細胞損傷。CPPs 的發(fā)現(xiàn)為生物大分子在細胞生物學、基因治療、藥物體內轉運、臨床藥效評價以及細胞免疫學等研究領域等均具有良好的應用前景。本文就 CPPs 的種類特點、內化機制、應用及其存在的問題進行討論和評述.

絕大多數(shù)疾病都需要在分子水平進行診斷治療。而人們面臨的一個主要問題是真核細胞和細胞器, 以及細胞壁和致病性微生物的膜, 使得許多具有很好的體外生物活性大分子包括藥物不能進入細胞內, 以至于無法發(fā)揮其應有的作用。為克服這些生物活性大分子在體內轉運的障礙, 人們已經發(fā)展了各種技術。運輸遺傳物質一般使用病毒載體, 但對于有些遺傳病這種方法似乎不可行。非病毒的方法, 像電穿孔、顯微注射及使用脂質體, 在常規(guī)和基因藥物運輸中得到了發(fā)展, 但顯微注射法或電穿孔法對細胞具有創(chuàng)傷性, 可能損傷甚至破壞細胞膜, 屬于侵襲性的方法。而非侵襲性的方法包括 pH 值敏感的脂質體, 要求在低酸環(huán)境下使膜失去穩(wěn)定性從而釋放藥物進入胞漿, 對于人體生理環(huán)境中藥物作用的研究具有一定局限性。

 在過去的幾十年里, 人們發(fā)現(xiàn)了一些肽和蛋白質能穿透細胞膜進入細胞內, 而且多種運載物分子也可以與這些肽和蛋白質連接并易位進入細胞內。這些肽和蛋白質載體構成一種新的很有潛力的藥物運輸載體,即細胞穿膜肽 (cell-penetrating peptides, CPPs), 它是一大類由 10～30 個氨基酸組成的短肽, 也稱為蛋白質轉導域 (protein translocation domain, PTD) 或“特洛伊木馬”肽 (Trojan horse peptides) 或轉導肽 (transduction peptide) 等。這些肽分子不會產生細胞膜永久性損傷, 并且毒性低。本文對于 CPPs的結構、性質、穿膜機制、應用前景及可能存在的問題等方面進行綜述。

1 細胞穿膜肽的性質、分類及結構特征

到目前為止,已發(fā)現(xiàn)了多種 CPPs, 它們共有的性質[1]: ① 具有凈正電荷性和兩親性; ② 穿膜轉運效高; ③ 可以導入近乎所有的細胞; ④ 可以攜帶多種活性物質進入細胞; ⑤ 可以通過固相合成或原核表達制備, 方法成熟簡便。CPPs 的分類以及統(tǒng)一的術語還沒有。根據(jù)不同的分類標準, 得到不同的種類。最近有學者根據(jù)短肽的特點和來源將其分為 3 大類: ① 蛋白衍生肽(protein derived CPPs), 如 penetratin、TAT 和 pVEC等; ② 模型肽(model peptides) 如MAP和 (Arg) 7等; ③ 設計肽 (designed CPPs) 如 MPG 和Transportan等[2]。從其兩親性性質[3]也可將其分為 3 類: ① 兩親性 CPPs (PaCPPs), 如 MPG、transportan、TP10、Pep-1; ② 中等兩親性 CPPs (SaCPPs), 如 penetratin, RL16; ③ 非兩親性 CPPs (NaCPPs), 如 R9。

2 細胞穿膜肽的跨膜過程及其機制

有關 CPPs 的內化機制一直以來存在爭議。不論通過何種機制穿膜, 理論上 CPPs 首先接近細胞膜的脂質層[4], 與其發(fā)生作用后進入細胞。

2.1 結合模式   目前認為 CPPs 與細胞膜的結合模式有兩種[5], 多位點結合模式和靜電吸引模式。多位點結合模式, 帶正電荷的 CPPs 可能與細胞膜上帶負電荷的葡糖胺聚糖結合, 也有可能與細胞膜上帶負電荷的脂質結合。CPPs 中存在的帶正電荷的堿性氨基酸與細胞膜上帶負電荷的物質結合是 CPPs 穿膜的必要條件。靜電吸引模式, 即通過疏水性吸附作用, 靠近膜表面的肽段發(fā)生非特異性的靜電積聚。Ziegler 等[3]根據(jù) CPPs 的兩親性程度分別闡述了其與膜的結合機制以及其在膜上的定位。PaCPPs 與膜結合時主要靠疏水作用插入膜內, 結構發(fā)生改變(α 螺旋或 β 折疊結構的形成), 且不耗能。SaCPPs 在與膜結合時結構發(fā)生改變, 通過靜電作用輕微插入脂質雙分子層。相反, NaCPPs 與膜結合時僅僅輕微吸附于膜上, 不會插入到脂質分子層中。PaCPPs 與SaCPPs 在穿膜時都會使脂質層發(fā)生紊亂, 形成跨膜靜電域,一些 CPPs 自組裝會進一步擾亂脂質雙分子層的完整性。而在低摩爾濃度、低陰離子脂質組分膜條件下, SaCPPs、NaCPPs 與膜之間不會發(fā)生相互作用。關于易位過程中肽與膜之間作用后形成的結構, 人們也提出了很多種模型[6]: 反相膠束模型, 局部電穿孔, 暫時的孔結構[7, 8], 誘導膜融合, 內吞通道[9]或幾種模型的結合。

2.2 內化機制   關于 CPPs 的內化機制 (穿膜機制/易位機制/轉導機制) 一般可分為兩種[10, 11]: 轉導(易位) 模式, 包括直接穿膜和跨膜轉導模式, 跨膜轉導模式 (translocation models)[12]又包括反轉微團(inverse micells)、地毯 (carpet) 及打孔 (barrel stave) 模型 (圖 1); 內吞模式 (endocytosis), 包括網格蛋白(clathrin, 120 nm)、脂質筏/小窩蛋白(caveolin, 50～80 nm)[13, 14]和巨胞飲 (macropinocytosis, 1～5 μm) 介導的模式 (圖 2)。轉導模式與內吞模式的主要不同在于轉導的 CPPs 在穿膜后直接定位于細胞質, 而內吞的CPPs 被限制在囊泡中。一般來說, 當 CPPs 運載小的親水性藥物時, 多肽誘導膜紊亂使肽直接易位進入胞內; 而當運載大的親水性藥物時膜紊亂程度較低, 內吞作用似乎是比較合適的易位機制[11]。

巨胞飲介導的內吞作用[15]是最近提出的一種CPPs 運載大分子藥物 (MW > 30 000 Da) 的入胞機制, 它是一種非網格蛋白、非脂質筏介導的依賴肌動蛋白的一種非特異性內吞過程。最近的研究重點是巨胞飲作用并認為其是細胞內化的主要途徑, 它能在不同程度上發(fā)生于所有的細胞內, 而且可以從膜的邊緣擾動和形成囊泡的大小兩個方面區(qū)分巨胞飲與其他形式的內吞作用。

 最近, 人們又提出了一種有關富含胍鹽基團的CPPs 的單獨運輸或其與小分子 (MW < 3 000 Da) 結合的運輸機制。CPPs 的胍鹽基團可以與細胞表面的負電性基團形成二齒狀的氫鍵, 產生的離子對在膜電位的作用下易位穿過細胞膜, 離子對在膜內部分離, 釋放出 CPPs 到細胞質中。也有可能是不同平衡離子 (兩親性的或親水性的) 的存在將導致 CPPs 的電荷中和或電荷重置, 這類 CPPs 在物理性質上的動力學因素的改變將促使其分配進入脂質雙分子層中(穿膜過程)。也有研究[16]認為陽離子穿膜肽與磷脂離子配對克服了穿膜過程中存在的固有能壘, 以一種非內吞作用的形式進入細胞內。不過, 研究證明, 一些外源兩親性平衡離子, 如十二烷基硫酸鈉或磷脂酰甘油/無機磷酸鹽在非生理條件下加入能夠促進CPPs 的體內內化。

CPPs 介導的無論小分子還是大分子的細胞內運輸機制有多種。一般來說, CPPs 或 CPP 與小分子的結合物內化進入細胞是通過靜電作用和形成氫鍵的易位或轉導作用; 而 CPP 與大分子的結合物是通過能量依賴的內吞作用, 特別是巨胞飲作用內化進入細胞[17]。含有胍鹽基團的 CPPs 可能以一種平衡離子介導的特殊穿膜機制進入細胞內。然而, 在這幾種情況下, CPPs 與細胞表面的陰性殘基的直接接觸是成功穿膜的必要條件。

CPPs 與藥物分子或基因或顆粒結合內化后的歷程與藥物分子、基因或顆粒本身的性質、CPPs 的性質及所選用的細胞體系密切相關。CPPs 或 CPPs-藥物分子可能的內化歷程[10]如圖 3 所示。如果 CPPs 或CPPs-藥物分子直接易位進入細胞質中, 可能會與細胞質中的一些靶向物相互作用, 使 CPPs 或 CPPs-藥物分子被運輸?shù)胶藘取⒈患毎|中的蛋白酶降解或很可能以完整分子或降解后的分子形式轉運到細胞外; 如果 CPPs 或 CPPs-藥物分子是以內吞作用機制內化, 其歷程取決于內吞機制的類型, CPPs 或 CPPs-藥物分子很可能經過溶酶體降解、可能在降解前從胞內體(內涵體) 中逃逸出來隨后進入細胞質中, 有可能進入核內, 到達高爾基體或內質網中或胞吞轉運到細胞外。

2.3 不同性質的 CPPs 的內化機制 不同性質的CPPs 會有不同的內化通道[3]。在低摩爾濃度和低陰離子脂質組分膜條件下, 只有 PaCPPs 在通過脂質雙分子層時呈現(xiàn)出直接易位作用, 且它們的直接易位作用在大分子藥物[18]和熒光基團的存在下減少。相反, SaCPPs 的直接易位作用要求在較高的肽濃度(>100 μmol·L−1) 和較高的陰離子脂質組分膜的條件下才能發(fā)生。NaCPPs 則要求更高的肽濃度 (>1 mmol·L−1) 和陰離子脂質組分膜 (70%) 才能夠擾亂膜發(fā)生直接易位作用。即在低摩爾濃度下, 內吞作用具有優(yōu)勢, 而直接易位作用在高濃度下才可能發(fā)生。

2.4 影響 CPPs 內化機制的因素 在評估細胞穿膜肽的內化有效性過程中存在不一致現(xiàn)象的原因是由于在比較時忽略了所用載體、藥物分子、濃度和細胞類型, 藥物分子的物理化學性質, 如親水性和所帶電荷可能會影響內化作用, 特別是非內吞作用的內化機制[19]。Patel 等[10]也提出在衡量 CPPs 內化作用時存在多方面的挑戰(zhàn)。因此, 非常有必要找出影響 CPPs內化機制的因素。

肽分子的性質與細胞膜的組成部分何者是主要的影響因素, 跨膜電位與肽/細胞比率何者更重要[20]?目前的研究表明, 肽與細胞表面蛋白聚糖之間相互作用和跨膜電位的存在都至關重要[12]。研究[21]發(fā)現(xiàn), CPPs 與藥物的結合降低了內化的有效性, 并極大地改變了 CPPs 的細胞內分布。也有研究認為小分子的藥物不影響內化的效率, 但大分子藥物, 內化效率明顯降低[2]。還有學者認為, 不同的穿膜肽在攜帶不同分子時采取的進胞方式可能有差異, 同時其進胞時間也會不同[11]。

從 CPPs 本身的結構性質來看, 肽分子的共同性質兩親性以及凈正電荷對肽分子與膜和藥物分子之間發(fā)生相互作用非常重要[6]。肽的結構和對肽的構象[22]有影響的環(huán)境因素都會對內化能力產生重要影響。肽結構的多樣性, 可能與它的兩親性或它的凈正電荷一樣是細胞自內化和其與脂質的相互作用所必需的特性。如果肽必須溶解在不同的環(huán)境中像水和膜中, 它就必須通過調節(jié)構象[23]來適應外部的環(huán)境。

綜合來看, 影響 CPPs 內化機制的因素主要有: 溫度、肽濃度、細胞周期、藥物分子大小及其理化性質、非固定化細胞中不同的亞細胞分布類型、CPPs的理化性質 (氨基酸構成、分子大小、分子構象)、所用的細胞系、胞內體中肽的降解、早期肽從胞內體中的逃速度及所結合配體的熒光強度等。

3 細胞穿膜肽的應用
大量研究表明, 穿膜肽具有強大的運載潛能, 與其他生物大分子轉運方式相比,穿膜肽的轉導作用具有許多獨特之處[24]。CPPs 攜帶的物質可以為蛋白質(綠色熒光蛋白、RNA 酶、半乳糖苷酶等)、多肽 (100個氨基酸殘基以下[23])、DNA、化學小分子藥物、寡核苷酸 (100 bp 以下[23])、反義核酸、肽核酸、納米顆粒、熒光素、有機分子、腺病毒載體、成像物質、脂質體及鐵顆粒等。運載能力[1]可以達到 120 kDa (如半乳糖苷酶)、40 nm (如鐵顆粒), 沒有明顯的證據(jù)表明運載極限。細胞穿膜肽可以通過化學結合或基因融合等方式攜帶各種生物大分子[5]。CPPs 與藥物的連接方式有兩種: 非共價連接和共價連接。通過使用CPPs 還可以增加肽類藥物的活性, 以及進行細胞器官的特異性運輸[25]。近年 CPPs 的應用進展如下。
 

3.1 蛋白質及多肽類藥物的運輸 對許多疾病使用外源蛋白質或多肽類藥物是一個非常有價值的治療方法。Wu 等[26]利用穿膜肽的蛋白轉導功能來介導信號肽-綠色熒光蛋白-穿膜肽 NT4-GFP-Ant 融合蛋白通過細胞膜和血腦屏障到達靶細胞。Tat (Tat48−60) 能將細胞周期蛋白依賴激酶抑制劑的細胞毒素肽模擬物 P21EAF1/CIP1運輸?shù)郊毎藘? 且研究[27]發(fā)現(xiàn)Tat48−60–P10 可以誘導細胞凋亡。Zhang 等[28]根據(jù)一種 α 螺旋肽 CAI 的結構設計出了一種細胞穿膜肽NYAD-1, 它比 CAI 具有更穩(wěn)定的 α 螺旋結構, 研究發(fā), NYAD-1能夠穿過細胞膜并與Gag聚蛋白共定位于質膜上, 破壞病毒顆粒的自組裝。研究者[29]設計了一種含有穿膜肽、彈性蛋白類似多肽 ELP (Val-Pro-Gly-Xaa-Gly) 和一種衍生于細胞周期蛋白依賴激酶抑制劑 P21 的結合多肽, 這種多肽能夠使 SKOV-3 卵巢癌細胞和HeLa 子宮癌細胞的生長速率減慢而抑制它們的增殖。HIV-Tat 與小泰勒蟲抗原 Tp2 結合形成重組at-Tp2 融合蛋白, 發(fā)現(xiàn)其能夠加強遲鈍的 CD8+T 細胞反應的興奮性[30]。
 

3.2 核酸類藥物的運輸 核酸類藥物的細胞運輸具有挑戰(zhàn)性。最近有關使用 CPPs 進行核酸細胞運輸?shù)睦虞^多。研究證明, 細胞膜穿透性寡肽——八聚精氨酸(R8) 修飾的脂質體可以有效輸送 siRNA 進入細胞并增強其生物學功能[31]。PalmApergi 等[32]研究一種細胞穿膜肽 MAP, 用這種典型的抗菌肽處理細菌產生細菌空殼, 這種空殼可以載入所需的 DNA 或質粒并將其運輸進入哺乳動物細胞內, 還可以用于預防接種。Meade 等[33]研究認為, CPPs 為雙鏈 siRNA 進行細胞內化去誘導 RNAi 反應提供了一種好方法。Veldhoen 等[34]研究發(fā)現(xiàn)一種新的載體肽 MPGα 能同時與核酸形成非共價連接的、具有高靈活性的復合物, 它可以作為運輸 siRNA 的載體。

與轉座子結合的“睡美人”轉座酶能將特殊基因轉移進目標動物體內。這些特殊基因有助于治療多種疾病。有研究[35]發(fā)現(xiàn)細胞穿膜肽 M918 可以完成“睡美人”轉座酶和一個外源轉座子質粒 (帶有一種抗生素基因) 在體外的細胞內共轉導運輸。具有空間位阻的帶電荷中性寡核苷酸類似物, 如 肽 核 酸 (PNA) 和 磷酰 二 胺 嗎啉代寡 核 苷 酸(PMO), 在反義引物的應用方面具有很好的生物學和藥理學性質。然而, 寡聚核酸在細胞內不能自由運輸, 因此, Lebleu 等[36]研究了兩種富含精氨酸的 CPPs (R-Ahx-R)4AhxB (R= 精氨酸, Ahx = 胺己苯酸酯, B= β-丙氨酸) 和 R6Pen, 它們能夠在胞內體溶解劑存在的情況下, 在低摩爾濃度下將 PNA 和 PMO 進行有效的核運輸。研究發(fā)現(xiàn), 固相合成穿膜肽 Tat 能夠攜帶質粒 DNA 穿過細胞膜進行基因轉染, 并對細胞活性無明顯影響[37]。
 

3.3 顆粒運輸 Liu 等[38]將 Tat 分子連接到生物活性聚合物核/殼納米粒的表面形成 Tat-PEG (聚乙醇)- b-chol (膽固醇) 復合物。研究發(fā)現(xiàn), 其可以穿過血腦屏障 (BBB) 進行藥物運輸, 并可以進入神經元細胞質。Wei 等[39]研究發(fā)現(xiàn)使用一種異型雙功能偶聯(lián)劑硫代琥珀酰亞氨基-4-對馬來酰亞氨基苯基丁酸酯 (sulfosuccinimidyl-4-(p-maleimidophenyl)-butyrate, SSMPB) 將 HIV-1 Tat 與 MS2 (噬菌體衣殼) VLPs (病毒樣顆粒) 結合, 此顆?？梢砸种票透窝撞《?HCV) 的 5'-非翻譯區(qū) (VTR) 和內核糖體進入位點(IREs) 的反義 RNA 的翻譯。Lu 等[40]研究發(fā)現(xiàn), 結核分歧桿菌膜蛋白 McelA 可以與膠態(tài)金顆粒和乳膠微球結合在 HeLa 細胞內內化。生物納米顆粒 BNC 是一種含有乙型肝炎病毒表面抗原 L-蛋白的空心納米粒。BNC 只能運輸基因或藥物進入特定的人類肝細胞中, 因此 Shishido 等[41]試圖從遺傳學上通過引入CPPs 的方法改變 BNC 的特異性。結果表明, CPPs 與BNC 的結合能夠在短時間內有效的內化進入各種細胞系, 而且沒有明顯的細胞毒性。
 

3.4 小分子藥物運輸 研究表明, 富含精氨酸的細胞穿膜肽可以直接運輸磷酸二酰胺嗎啉齊聚物進入鼠類白細胞, 抑制其基因表達和改變前體 mRNA 的剪接[42]。Lindgren 等[43]設計了一種 CPP 與細胞抑制劑甲氨蝶呤 (MTX) 的結合物, 用于克服乳腺癌腫瘤細胞對甲氨蝶呤的耐受。將 2', 5'-寡腺甙酸四聚物(2-5A) 與短鏈 HIV-1Tat 肽用化學方法結合產生2-5A-Tat 嵌合體[44], 此嵌合體可以被細胞吸收并能在完整的細胞中活化核糖核酸酶 L, 它可能為 HIV的RNA 在體內的靶向破壞提供了一種方法。
 

3.5 增強藥物的吸收及其他特殊功能 Kamei 等[45]發(fā)現(xiàn)通過使用 CPPs 可以促進胰島素的腸內吸收。Khafagy 等[46]研究發(fā)現(xiàn) L-型穿膜肽 penetratin 可以顯著增加胰島素的滲透性而使其穿過鼻膜, 并對鼻吸收黏膜上的細胞完整性不會引起明顯的破壞。Tunnemann 等[47]研究認為細胞穿膜肽介導的肽轉導作用不僅是一種對細胞內 Ca2+無副作用情況下可以增加心肌功能的唯一方法, 而且是一般細胞或干細胞中蛋白質之間相互作用的調節(jié)和控制的非常有用的工具。Kloss 等[48]研究發(fā)現(xiàn), 含有 4～10 個精氨酸殘基的寡聚精氨酸, 特別是 (Arg)8 能夠抑制細胞內主要的蛋白水解系統(tǒng)。當考慮寡聚精氨酸作為藥物的細胞內運輸載體時, 必須考慮其對蛋白酶的抑制活性問題。有研究報道, 成功設計的一種新的穿膜肽Pep-1-K (衍生于穿膜肽Pep-1) 具有強的抗菌活性, 可以作細菌選擇性抗菌肽[49]。Johansson 等[50]研究發(fā)現(xiàn)了一種含有 22 個氨基酸殘基的衍生于腫瘤抑制基因 P14ARF 的 N 端部分的肽 ARF (1-22), 它是一種具有 P14ARF 功能的類似物, 對細胞膜有穿透性, 膜破壞性低且能誘導細胞凋亡。以前研究認為大多數(shù)CPPs 可以易位穿過哺乳動物細胞質膜, 而不能穿過像酵母細胞的細胞膜。然而, Parenteau 等[51]對 20 種CPPs 進行了測試, 發(fā)現(xiàn)有一種肽 Tp10 能有效的穿過裂殖酵母細胞并在細胞內均勻分布。由于治療分子不能穿過質膜, 基因和藥物運輸進入眼部組織, 例如視網膜和角膜被阻礙, Johnson 等[52]研究發(fā)現(xiàn)了一種能用于眼部組織運輸?shù)男码?POD, 能夠運輸小分子和大分子藥物進入神經視網膜上皮細胞和角膜細胞等。如果能夠通過高分辨率成像技術追蹤干細胞的分布和分化的能力, 對臨床和研究非常重要。Liu等[53]用一種典型的 CPP 承載釓顆粒, 此顆?？梢杂糜诠撬栝g質干細胞的磁共振成像。熒光成像技術確定此復合物可以內化進入干細胞質和核內,毒性實驗和流式細胞儀分析表示此復合物不會影響細胞的生存和膜電勢梯度。關于 CPPs 的氨基酸序列見表 1。

4 細胞穿膜肽在應用中存在的問題
CPPs 在治療應用中存在的主要問題是使藥物分子到達細胞質去誘導所需的生物反應, 藥物分子必須從胞內體中逃逸出來。胞內體的釋放是各種陽離子CPPs 細胞內運輸過程中的主要限速步驟, 有報道稱可以使用胞內體-瓦解肽、酸敏感的腙鍵或激光觸發(fā)胞內體孔使胞內體釋放等。Shiraishi 等[54]提出光化學內化 (PCI) 方法, 通過使用光敏劑可以有效地釋放嵌入胞內體中的藥物分子。但這些物質的應用對其他方面是否有影響目前尚不清楚。因此, 有關胞內體的釋放還需要進一步研究。一旦 CPPs 承載藥物分子進入細胞內, 另一個面臨的問題是怎樣把藥物分子運輸?shù)缴锘钚晕稽c?？梢酝ㄟ^將肽序列與細胞內信號序列結合解決。但此法是否可行還有待探究。將穿膜肽用作臨床藥物的運輸工具, 首先必須確認肽本身不會對正常細胞造成不利影響, 由于CPPs 具有高陽離子性[55], 因此人們擔心它們會和其他的陽離子多聚物如聚 L-賴氨酸或聚乙烯亞胺 (PEI) 一樣存在一定的毒性。一般來說, CPPs 在高濃度肽下才會產生細胞毒性, 但兩親性強的 PaCPPs 在低摩爾濃度下已經具有細胞毒性[3]。在這方面已進行了一些研究, 但大多是體外實驗[11]。

CPPs 與治療性分子的結合物幾乎分布于身體的各個部分而不依賴于給藥的方式?；?CPPs 缺乏細胞特異性的性質, 人們試圖通過將帶有負載的 CPPs與細胞特異識別分子相結合介導特異性細胞運輸。與所設想一致, 細胞特異抗體與 CPPs 的結合確實增加了它們的細胞內化作用。它也同時明顯地減少了抗體在體內的選擇性。研究表明, 抗體的應用不易滿足靶向性要求。目前, 抗體的直接靶向性所面臨的主要問題: 肽分子進入細胞的非特異性與抗體和其靶向細胞的特異性配體的親和性之間存在一定的沖突。因此, 有研究者認為將 CPPs 的穿膜活性暫時隱蔽起來, 直到 CPPs-抗體復合物到達靶向組織和適合的細胞周圍后再使 CPPs 釋放[56]。另有學者設想, 通過對藥物靶向組織所分泌的蛋白酶敏感的化學鍵將 CPPs 與某種藥物分子相連[57], 從而使得靶向藥物分子聚集在靶標組織周圍。

CPPs 在藥物運輸過程中的使用存在的另外一個弊端是其穩(wěn)定性差。CPPs 內化后, 由于體內含有各種蛋白酶, 它可能會酶解外源 CPPs 及其藥物分子; 體內的環(huán)境包括 pH 值、離子濃度等都有可能改變CPPs 的某些性質使其失去活性。因此, 必須通過尋找新的穩(wěn)定的CPPs[58]或對現(xiàn)有的 CPPs 進行修飾改進來解決這方面的問題。一些蛋白在內化進入細胞后不再具有生物活性, 可以考慮在蛋白和 CPPs 之間插入一個連接分子來輔助在細胞內釋放有活性的蛋白和藥物。此外, CPPs 是否有免疫原性或半免疫原性及長期應用會對機體產生何種影響, 需要將 CPPs 序列進一步的優(yōu)化以提高其適用性[59]。一些證據(jù)顯示, CPPs可以與任意的分子結合, 非靶向性進入細胞內, 導致生物活性藥物不必要的損失。因此, 如果不能建立可行性使用方法以促進細胞特異性運輸, 將限制細胞穿膜肽在機體內運輸藥物等方面的應用。

目前, 在能夠有效利用 CPPs 運輸藥物以充分發(fā)揮治療作用方面有價值的應用實驗結果還鮮見報道。這種載藥方式在應用中是否存在潛在的細胞毒性以及運輸過程中缺乏細胞特異性等問題尚未引起足夠的的重視[60]。一些 CPPs 存在細胞內化差, 出現(xiàn)細胞內代謝性降解及一些不良的生物效應如毒性和免疫原性等。需要進一步開展對 CPPs 的藥代動力學、體內分布等相關研究。
5 展望
CPPs 的發(fā)現(xiàn)為生物大分子用于疾病治療帶來了曙光, 在細胞生物學、基因治療、藥物體內轉運、評價及細胞免疫學等研究領域均具有良好的應用前景。但在 CPPs 真正應用于臨床前仍有一系列問題需要解決。CPPs 在體內缺乏組織特異性和細胞類型特異性, 因此增加轉導肽的靶向性則是將來發(fā)展的一個目標, 需要構建靶向部分。而噬菌體展示技術篩選出來的細胞特異 CPPs 提供了一個很有前景的方法。因 CPPs在體內的酶解性, 體內運輸效果的不確定性, 可能存在的神經毒性和免疫原性等, 最近細胞穿膜非肽分子載體得到發(fā)展, 如肌醇、蔗糖、乳糖、多羥糖醇 (山梨醇) 等[61]。除了 CPPs 外, 一些含有幾個氨基酸 (從3到10個) 具有細胞特異性并且可以通過內吞作用內化的不同肽相繼被發(fā)現(xiàn), 這些肽稱為細胞靶向肽(CTPs)[55], 并用于各種治療分析中。CTPs 與一些給定的細胞系專有表達的受體之間的相互作用具有高特異性和很強的親和性。鑒于 CPPs 表現(xiàn)出的穿膜特性與 CTPs 表現(xiàn)出的高特異性和親和性。CPPs 與CTPs 的共用是否能達到希望的運輸目的, 還需要進一步研究。