摘要: 本文擬構建一種模擬細胞外基質結構與功能的基因活化支架 (ECM-m-GAM), 并對其結構、機械強度和釋放性能進行表征。首先制備細胞穿膜肽 TAT 修飾的脂質體基因載體 TAT-LPD, 然后將 TAT-LPD 與 RGD 修飾的透明質酸混合, 加入交聯(lián)劑 MMPs 敏感肽 (HS-MMP-SH), 使透明質酸凝膠化, 在凝膠化過程中實現(xiàn)對TAT-LPD 的負載, 從而將細胞黏附因子 RGD、MMPs 敏感底物和高效的基因轉染載體 TAT-LPD 有機地整合到 一個結構中, 完成 ECM-m-GAM 的構建。利用 PicoGreen 試劑盒考察 ECM-m-GAM 在不同釋放介質中 DNA 的釋放行為。研究結果表明: TAT-LPD 在透射電鏡下呈球形, 平均粒徑為 (263.0 ± 4.30) nm, 可被成功地包埋在ECM-m-GAM 中; ECM-m-GAM 具有典型的凝膠結構, 機械強度隨著透明質酸用量的增加而增強, 透明質酸用量為 4%時其彈性模量約為 1 600 Pa, 適合支架植入和組織修復; DNA 從 ECM-m-GAM 中的釋放呈現(xiàn)明顯的 MMPs敏感性, 并且釋放的 DNA 仍以納米粒的形式存在, 能夠轉染大鼠骨髓間充質干細胞 (BMSCs) 并表達綠色熒光, 為后續(xù)的細胞轉染和組織修復研究奠定了基礎。

隨著醫(yī)學技術的迅猛發(fā)展, 利用組織工程技術進行缺損組織和器官的修復與再生已成為一種極具潛力的治療手段, 生長因子是組織工程中應用的重要的細胞營養(yǎng)物質, 具有誘導和刺激細胞增殖、維持細胞存活等多方面的生物功能。然而, 生長因子多為蛋白類藥物, 其半衰期比較短, 在體內容易失去生物活性, 只能在短期內產(chǎn)生效果, 此外, 生長因子的價格昂貴, 治療成本高。
近年來, 基因治療技術的發(fā)展及其在組織工程領域的應用為這些問題的解決提供了新的策略。將編碼有生長因子并具有轉染能力的 DNA 融合于生物可降解材料中構建含 DNA 的生物支架, 即基因活化支架 (gene-activated matrix, GAM)[1]。將 GAM 直接植入到組織缺損區(qū), 可在植入部位釋放 DNA 并轉染附近的細胞。一旦轉染成功, 細胞將成為生物反應器, 持續(xù)表達并分泌基因所編碼的生長因子, 達到對細胞分化和組織再生調控的目的[2, 3]。GAM 在結構上包含 DNA 復合物和支架材料兩部分, 這兩部分的功能決定了 GAM 的功能。目前, 關于 GAM 的研究熱點主要集中于仿生支架的設計及如何實現(xiàn)高效的 DNA轉染這兩個方面。

細胞外基質 (extracellular matrix, ECM) 是體內細胞生長的微環(huán)境, 是由纖維蛋白和多糖組成的復雜的網(wǎng)架結構, 它通過黏附因子與細胞表面受體結合, 促使細胞在基質上附著, 細胞則通過自身釋放的酶降解基質, 為自身的遷移和增殖創(chuàng)造空間, ECM 對維持細胞的生理活動具有重要的作用。支架作為承 載細胞附著、生長和增殖的微環(huán)境, 應最大程度地模擬 ECM 的功能。凝膠是組織工程中常用的支架形式, 其交聯(lián)網(wǎng)絡的多孔結構利于細胞的遷移及活性物質的傳遞, 可以很好地模擬 ECM 的網(wǎng)架結構。基質金屬蛋白酶 (matrix metalloproteinase, MMPs) 屬于細胞內的蛋白水解酶家族。在組織修復過程中, 細胞能夠分泌 MMPs, 它幾乎能降解 ECM 中的各種蛋白成分, 從而為細胞的遷移與增殖提供空間。RGD 肽是一類含有精氨酸−甘氨酸−天冬氨酸 (Arg-Gly-Asp) 的短肽, 存在于多種生物細胞外基質中, 能特異性識別細胞表面的整合素并與之結合, 是細胞在 ECM 中附著和遷移的識別部位。受此啟發(fā), Lutolf 等[4]用 MMPs敏感肽交聯(lián)聚乙二醇 (PEG) 制備 PEG 凝膠, 再將RGD 連接到凝膠上構建細胞支架。該凝膠支架兼具細胞黏附因子 RGD 及 MMPs 敏感性。依靠 RGD 介導及 MMPs 的酶解作用, 人纖維母細胞能夠吸附并侵入凝膠內部, 體內研究表明負載骨形成蛋白 BMP-2 的凝膠支架具有良好的骨修復作用。Kim 等[5]將 RGD修飾的透明質酸用 MMPs 敏感肽交聯(lián)制備凝膠支架, 更好地仿生了ECM的功能, 因為透明質酸是ECM中的主要成分, 它存在于遷移細胞的周圍, 能夠抑制細胞間的黏附, 促進細胞遷移。Lei 等[6]考察了小鼠間充質干細胞在上述凝膠支架中的生長情況, 結果表明 MMPs 敏感性及 RGD 的存在有利于細胞在支架中的遷移、生長和增殖。

細胞穿膜肽 TAT (transcriptional activator protein) 具有高效的入胞能力, 能夠迅速破壞內吞體膜, 逃 逸溶酶體。TAT 已經(jīng)成功攜帶多種生物活性物質及 載體, 包括蛋白質、DNA、多肽、納米粒和脂質體等進行細胞內傳輸, 是一種新型而高效的藥物遞送工具[7, 8]。利用 TAT 修飾非病毒載體可以實現(xiàn)高效的基因轉染。Torchilin 等[9]用 TAT 修飾負載 DNA 的脂質體, 構建 TAT-liposome-DNA 復合物, 其對鼠 NIH/3T3成纖維母細胞和 H9C2 心肌細胞的轉染效率顯著高于未經(jīng) TAT 修飾的 DNA 脂質體。

本文率先提出構建一種新型的“細胞外基質仿生型基因活化支架”(ECM-mimicking-GAM, ECMm-GAM): 用 TAT 修飾脂質體作為高效的基因轉染載體, 將其與 RGD 修飾的透明質酸混合, 加入交聯(lián)劑MMPs 敏感肽 (HS-MMP-SH) 使透明質酸凝膠化, 得到脂質體/凝膠復合系統(tǒng)。從而將具有高效轉染能力的 TAT 脂質體、細胞黏附因子 RGD 和對細胞分泌酶 MMPs 敏感的交聯(lián)鏈整合到同一個結構 (透明質酸凝膠) 中, 完成 ECM-m-GAM 的構建。本文將優(yōu)化并報道該支架的制備方法, 表征其表面形態(tài)和機械性能, 評價其對 DNA 復合物的負載及 MMPs 敏感性釋放行為, 為細胞轉染及組織修復研究奠定基礎。