摘要 血腦屏障(blood-brain barrier, BBB)嚴格調(diào)控物質(zhì)進出中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system, CNS), 是CNS治療的重要障礙。源自狂犬病病毒糖蛋白(rabies virus glycoprotein, RVG)的多肽具有高度嗜神經(jīng)性, 能夠特異性結(jié)合CNS中的煙堿型乙酰膽堿受體(nicotinic acetylcholine receptor, nAChR), 可通過受體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)胞吞(receptor-mediated transcytosis, RMT)機制穿過BBB將綴合的核酸、蛋白質(zhì)分子遞送至特異性組織、細胞中。RVG肽還能結(jié)合CNS藥物遞送載體外泌體、納米顆粒, 賦予其CNS靶向特性。該文就RVG肽來源、靶向機制及其結(jié)合外泌體、納米顆粒進行CNS靶向遞送進行綜述, 這為CNS治療提供了一種安全、無創(chuàng)的遞送策略。

血腦屏障(blood-brain barrier, BBB)由連續(xù)、無窗的中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system, CNS)內(nèi)皮細胞在神經(jīng)血管單位誘導(dǎo)下形成, 嚴格調(diào)控正常神經(jīng)元所需的微環(huán)境[1]。BBB阻止100%的大分子和98%以上的小分子藥物進入CNS[2]; 穿過BBB進行CNS治療面臨藥物選擇性差、BBB破壞、低BBB滲透或快速消除等挑戰(zhàn)[3]。外泌體、納米顆粒被發(fā)現(xiàn)能夠克服BBB進行CNS遞送, 然而其均具有靶向性低的不足。基于BBB特性, 多種轉(zhuǎn)運蛋白、受體蛋白被用于CNS靶向遞送[3]。RVG肽具有高度嗜神經(jīng)性, 能夠通過受體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)胞吞(receptor-mediated transcytosis, RMT)機制將綴合的分子遞送至皮質(zhì)、海馬及神經(jīng)元、小膠質(zhì)等組織、細胞中; RVG肽還可結(jié)合外泌體、納米顆粒，賦予其CNS靶向能力; 偶聯(lián)RVG肽的外泌體、納米顆粒能夠裝載基因及藥物分子進行CNS靶向遞送, 基因及藥物分子發(fā)揮后續(xù)疾病治療、腫瘤成像、科學(xué)研究等作用。因此, RVG肽為CNS靶向遞送提供了一種新的方法。

1 RVG肽來源 

狂犬病病毒糖蛋白(rabies virus glycoprotein, RVG)是狂犬病病毒膜上插入的一個65 kDa的三聚體I型糖蛋白[4], 成熟RVG由505個氨基酸組成, 包括細胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和細胞外結(jié)構(gòu)域三部分[5]。RVG具有高度嗜神經(jīng)性, 能夠識別特異性受體, 在低pH下誘導(dǎo)病毒與靶細胞融合, 介導(dǎo)病毒在CNS中的逆向軸突傳播, 但不參與病毒基因組的轉(zhuǎn)錄、復(fù)制[6-7]。RVG肽是從RVG受體識別關(guān)鍵序列189—214中衍生的由29個氨基酸(YTIWMPENPRPGTPCDIFTNSRGKRASNGGGG)組成的短肽, 具有低免疫原性, 能夠特異性識別CNS受體靶向遞送基因及藥物分子[8]。

2 RVG肽CNS靶向機制

研究發(fā)現(xiàn), RVG肽能夠特異性識別并結(jié)合CNS中普遍存在的煙堿型乙酰膽堿受體(nicotinic acetylcholine receptor, nAChR), 并被α-銀環(huán)蛇毒素競爭性抑制[9]。nAChR是一種五聚體配體門控離子通道, 廣泛分布于腦微血管內(nèi)皮細胞、丘腦、紋狀體、海馬、皮質(zhì)等多種CNS結(jié)構(gòu)中[6-10]。RVG肽與nAChR結(jié)合后, 通過RMT機制介導(dǎo)物質(zhì)或載體穿過BBB(圖1)[11]。RMT是BBB高度特異性運輸系統(tǒng)的一部分, 負責(zé)CNS內(nèi)必需的肽或蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)的轉(zhuǎn)運[12]; RMT通過配體–受體相互作用介導(dǎo)BBB內(nèi)皮細胞以內(nèi)吞方式攝取腔膜側(cè)大分子, 經(jīng)細胞內(nèi)轉(zhuǎn)運后以胞吐方式將分子釋放到基底膜側(cè), 受體通過再循環(huán)回到腔膜側(cè)[13-14]。靶向RMT已被成功用于跨BBB遞送生物治療性物質(zhì); 與參與BBB穿透的被動擴散途徑相比, RVG肽與nAChR介導(dǎo)的物質(zhì)轉(zhuǎn)運對BBB具有高度特異性, 可有效提高藥物分子的治療效率[15-16]。

3 RVG肽CNS靶向遞送

靶向給藥的主要目標是減少藥物的非特異性攝取, 以及促進藥物在靶組織、細胞的累積?；赗VG肽的CNS特異性、BBB穿透性、低免疫原性以及無創(chuàng)性等特點, RVG肽被用于結(jié)合核酸、蛋白質(zhì)等治療分子進行CNS靶向遞送。相比于大分子蛋白載體, 肽具有較小的分子量、易于合成、低細胞毒性及可降解等優(yōu)勢[17]。

3.1 遞送核酸分子

RVG肽不能直接結(jié)合核酸 , KUMAR等 [18]在RVG肽羧基末端加入壬基精氨酸殘基合成嵌合肽RVG-9R, 使RVG-9R通過靜電相互作用結(jié)合siRNA。其在體外靶向表達nAChR的神經(jīng)細胞并轉(zhuǎn)導(dǎo)siRNA, 引起有效的基因沉默。靜脈注射結(jié)合抗病毒siRNA的RVG-9R對致死性病毒性腦炎小鼠提供了有力的保護, 且經(jīng)反復(fù)給藥后未誘導(dǎo)炎性因子或抗肽抗體產(chǎn)生。KIM等[19]發(fā)現(xiàn), RVG-9R能夠?qū)iRNA靶向遞送至表達nAChR的CNS巨噬細胞/小膠質(zhì)細胞, 抑制腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥和神經(jīng)元凋亡。ROHN等[20]研究表明, RVG肽可轉(zhuǎn)染cdk4 siRNA, 使得Neuro2A細胞中cdk4的表達水平減少75%; 立體定向注射可將cdk4 siRNA特異性遞送到海馬神經(jīng)元, 在注射部位400 µm處敲低cdk4表達。因此RVG肽被證明提供了一種高效、安全的方法, 用于穿過BBB靶向CNS遞送siRNA及潛在治療分子。

VILLA-CEDILLO等[21]為提高基因?qū)肷窠?jīng)細胞的效率, 在RVG肽中引入Asn194Lys突變。突變型RVG肽、親核肽及編碼綠色熒光蛋白的質(zhì)粒形成的復(fù)合物能夠通過能量依賴的胞吞作用將 DNA分子遞送到神經(jīng)元細胞中。Asn194Lys突變增加了基因向神經(jīng)母細胞瘤和星形膠質(zhì)細胞的傳遞。這種新的RVG多肽的親核能力使其有希望作為基因輸送載體進入腦細胞。

3.2 遞送蛋白質(zhì)

XIANG等[22]通過基因工程構(gòu)建質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞將RVG肽與β-半乳糖苷酶(beta-galactosidase, β-Gal)融合, 在靜脈注射或胃內(nèi)給藥后, RVG肽均能將生物活性蛋白穿過BBB遞送到海馬區(qū)神經(jīng)元。這可能為用于神經(jīng)退行性疾病, 如阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)等的蛋白質(zhì)療法提供新的策略。ZOU等[23]將RVG肽與基因編輯蛋白Cre重組酶結(jié)合, 經(jīng)尾靜脈注射將RVG-Cre全身性遞送到兩個Cre報告小鼠系中, 證明RVG-Cre可以靶向大腦皮層并介導(dǎo)體細胞中有效的基因組編輯。這種通過RVG肽將基因編輯酶蛋白直接導(dǎo)入小鼠大腦的方法比基于質(zhì)?；虿《镜姆椒ㄒ踩枚? 有望在各種CNS疾病治療中進一步應(yīng)用。

4 RVG肽結(jié)合外泌體

外泌體 (exosomes, Ex)是一種用于細胞間通訊、可由多種細胞分泌的膜結(jié)合納米囊泡, 直徑約30~150 nm, 是核酸和蛋白質(zhì)的天然載體[24]; 因其具有天然跨越BBB的特性, 故而成為CNS理想的藥物遞送工具[25]。Ex具有良好的生物相容性、循環(huán)穩(wěn)定性、生物屏障通透性、低免疫原性和低毒性等優(yōu)勢[26]。然而, 天然Ex存在特異性CNS靶向能力低, 易積聚于肝腎組織進而導(dǎo)致清除不足[27]。溶酶體相關(guān)膜蛋白2b(lysosome-associated membrane protein 2b, Lamp2b)是Ex膜表面大量表達的非特異性單跨膜蛋白, 常被用作嵌合表達蛋白載體來制備連接RVG肽的工程靶向Ex(即RVG-Ex)[28]。RVG肽可與不同來源的Ex結(jié)合, 介導(dǎo)其CNS靶向遞送, 增強受體細胞攝取, 減少藥物脫靶效應(yīng)[29-30]。

4.1 結(jié)合樹突狀細胞源性Ex

ALVAREZ-ERVITI等 [31]首次構(gòu)建了 Lamp2b N-端融合RVG肽的質(zhì)粒, 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染樹突狀細胞(dendritic cells, DC)獲取低免疫原性RVG-Ex, 用電孔法使RVG-Ex負載siRNA, 裝載siRNA的RVG-Ex通過RVG的CNS靶向性將GAPDH siRNA遞送至小鼠神經(jīng)元、小膠質(zhì)細胞及少突膠質(zhì)細胞中引發(fā)特定的基因敲除。相比單純的RVG肽, RVG-Ex可更有效地將AD治療靶基因BACE1 siRNA遞送至CNS中, 強烈敲除BACE1 mRNA(60%)和蛋白質(zhì)(62%)表達。EL-ANDALOUSSI等[32]研究表明, DC源性RVG-Ex可將siRNA靶向遞送至中腦、皮質(zhì)和紋狀體中, 敲除60%的RNA和蛋白質(zhì)表達, 且在重復(fù)給藥后未發(fā)現(xiàn)毒性或免疫原性。該體系還可將 α-突觸核蛋白(alpha-synuclein, a-Syn) siRNA、shRNA微環(huán)(shRNA-MCs)遞送至質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元, 顯著降低中腦、紋狀體和皮質(zhì)中a-Syn的病理性聚集, 減少多巴胺能神經(jīng)元丟失, 改善帕金森病(Parkinson’s disease, PD)癥狀[33-34]; 將miR-124遞送至CNS中可減輕可卡因介導(dǎo)的小膠質(zhì)細胞激活引發(fā)的神經(jīng)炎癥[35]。這表明RVG-Ex遞送策略能夠向CNS遞送基因物質(zhì)用于AD、PD等疾病診療。

4.2 結(jié)合干細胞源性Ex

YANG等[36]將表達RVG肽的Lamp2b質(zhì)粒轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)獲取BMSCs源性RVGEx, 將負載的miR-124有效遞送到卒中后梗死部位, 通過miR-124發(fā)揮促進皮質(zhì)前體細胞再生, 保護卒中引起的缺血性損傷作用。LAI等 [37]用 BMSCs源性 RVG-Ex向動脈瘤性蛛網(wǎng)膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage, SAH)區(qū)遞送miR-193b-3p, 來抑制HDAC3的表達和活性, 上調(diào)NF-κB p65的乙?；蓽p輕炎癥反應(yīng)和神經(jīng)行為缺損。CUI等 [38]將 RVG肽修飾的間充質(zhì)干細胞 (mesenchymal stem cells, MSCs)源性Ex靶向遞送至轉(zhuǎn)基因APP/PS1小鼠皮層和海馬, 通過Ex中繼承自干細胞的相關(guān)基因物質(zhì)來降低β-淀粉樣蛋白(amyloid-β, Aβ)水平, 顯著改善AD小鼠學(xué)習(xí)記憶能力。

4.3 結(jié)合人胚胎腎細胞源性Ex

KIM等[39]使用人胚胎腎細胞系(HEK293T)制備RVG-Ex, 用電穿孔法裝載HMGB1 siRNA, 經(jīng)靜脈遞送至CNS用于缺血性卒中治療。相比未修飾Ex, RVG-Ex更有效地降低了CNS中HMGB1、TNF-α的表達水平, 抑制了細胞凋亡, 縮小了梗死面積。該體系還可將神經(jīng)生長因子(nerve growth factor, NGF)靶向遞送至缺血皮層來重塑小膠質(zhì)細胞極化 , 調(diào)節(jié)神經(jīng)炎癥反應(yīng) [40]。HEK293T源性 RVG-Ex還可向CNS遞送特異性識別a-Syn的DNA適配體減少腦內(nèi)a-Syn病理性聚集來治療PD[41]; 遞送CD10突變體(CD10dm)調(diào)節(jié)腦內(nèi)炎癥反應(yīng)用于AD治療[42]。LIU等[43]將表達RVG肽的質(zhì)粒和阿片類受體mu(MOR) siRNA共轉(zhuǎn)染HEK293T細胞, 使MOR siRNA與Ex的AGO2蛋白結(jié)合后靶向遞送至腦皮質(zhì)中, 通過下調(diào)MOR的表達水平來介導(dǎo)嗎啡復(fù)發(fā)的治療。這些研究表明, RVG肽可成功介導(dǎo)Ex靶向CNS遞送核苷酸、蛋白質(zhì)等物質(zhì)用于AD、PD、卒中等CNS疾病治療(表1)。

5 RVG肽結(jié)合納米顆粒

納米顆粒(nanoparticles, NPs)包括聚合物納米顆粒、樹枝狀聚合物、脂質(zhì)納米顆粒及無機納米顆粒等多種類型[44], 可以將用于PD、AD、腦腫瘤等疾病的基因治療物質(zhì)、蛋白質(zhì)、熒光探針等多種物質(zhì)遞送到CNS中。NPs在多功能化、攜帶藥物有效載荷的能力、控制藥物釋放和改變藥物的藥物動力學(xué)方面具有優(yōu)勢[45]。NPs可以綴合RVG肽通過RMT機制穿過BBB靶向CNS遞送物質(zhì)分子(表2)。異雙官能團聚乙二醇(NHS-PEG-MAL)可作為連接頭, 其中MAL基團與RVG肽末端的半胱氨酸殘基反應(yīng), NHS基團與NPs胺基結(jié)合, 完成RVG-NPs制備; PEG還能增強聚合物納米顆粒的穩(wěn)定性、生物相容性和體內(nèi)靶向性[46-48]。

5.1 結(jié)合陽離子聚合物

引入二硫鍵的陽離子聚合物聚乙烯亞胺 (SSPEI)具有低免疫原性、生物可降解等優(yōu)勢, 能夠通過靜電相互作用結(jié)合miR-124a、pDNA, 經(jīng)RVG肽修飾后可穿透BBB將其特異性遞送至CNS中表達nAChR的神經(jīng)元胞質(zhì)中介導(dǎo)基因治療[49]。RVG肽修飾的聚(甘露醇–共-PEI)基因轉(zhuǎn)運體(PMT)通過與BBB表達的nAChR結(jié)合, 將BACE1 siRNA遞送至小鼠海馬和皮層用于AD治療[50]。共結(jié)合RVG肽和陽離子聚合物殼聚糖的基于pluronic的NPs具有結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、易裝載蛋白質(zhì)、無細胞毒性等優(yōu)點, 可實現(xiàn)β-Gal等蛋白質(zhì)在腦內(nèi)的有效遞送, 被用作CNS靶向成像和蛋白質(zhì)遞送載體[47]。

5.2 結(jié)合聚合物NPs

聚合物NPs包括聚乙二醇(PEG)、聚(乳酸–共–乙醇酸)(PLGA)和聚乳酸(PLA)等。RVG肽標記的由聚乙二醇化聚天冬氨酸酰肼(PAHy)衍生物組成的新型聚離子復(fù)合物(PIC)膠束負載的siRNA更容易被Neuro2A細胞內(nèi)化, 具有更強的CNS靶向能力, 能有效抑制基因表達[48]。由RVG肽、P-糖蛋白抑制劑(P85)共修飾的桿菌肽A聚乙二醇化納米載體通過RMT途徑、ATP耗竭和膜微黏度降低的協(xié)同作用穿過BBB在腦實質(zhì)蓄積, 抑制藥物敏感和耐藥肺炎鏈球菌在腦內(nèi)的生長, 來治療肺炎球菌腦膜炎[51]。

YOU等[52]研究表明連接RVG肽的PLGA可向CNS靶向遞送去鐵胺, 降低黑質(zhì)紋狀體內(nèi)的鐵含量和氧化應(yīng)激水平, 減輕多巴胺能神經(jīng)元損傷, 逆轉(zhuǎn)神經(jīng)行為缺陷, 延緩PD進展; 該體系還可遞送miR-124降低促炎因子, 升高神經(jīng)保護因子水平, 并靶向NF-κb通路, 降低MEKK3和P-p65表達, 改善PD的神經(jīng)炎癥[53]; 遞送天然自噬誘導(dǎo)劑4,4’-二甲氧基查耳酮(DMC)至神經(jīng)元和小膠質(zhì)細胞, 減輕炎癥反應(yīng), 改善PD小鼠運動缺陷[54]。

LEE等[63]發(fā)現(xiàn), 聚(D,L-丙交酯–乙交酯)(PLG)納米顆粒包裹碳酸鈣可形成產(chǎn)氣聚合物納米顆粒(GNPs), 在酸性條件下釋放二氧化碳來增強超聲信號。RVG肽修飾, 可將GNPs靶向積聚在神經(jīng)母細胞瘤中, 用于腫瘤超聲成像。該體系還可攜帶熒光探針檢測神經(jīng)母細胞瘤荷瘤小鼠中的腫瘤部位, 包裹治療性基因雞尾酒(siMyc、siBcl-2和siVEGF)可顯著抑制腫瘤生長[55]。

5.3 結(jié)合樹枝狀聚合物

干細胞對非病毒基因轉(zhuǎn)染試劑的容受性很差, BELOOR等[56]將RVG偶聯(lián)到氧化還原敏感型樹枝狀可降解精氨酸接枝聚合物(PAM-ABP)上, 可在不改變母體DNA釋放特性和低毒性的前提下, 與質(zhì)粒DNA形成納米顆粒, 向人類胚胎干細胞和MSCs轉(zhuǎn)染非病毒基因。RVG-PAM-ABP是一種具有生物還原性、生物相容性、無毒的, 用于向表達nAChR的干細胞進行基因輸送的新型合成系統(tǒng)。

5.4 結(jié)合脂質(zhì)NPs

脂質(zhì)NPs可分為固體脂質(zhì)NPs(SLN)和納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體(NLC)[64]。偶聯(lián)RVG肽、包被殼聚糖的SLNS將BACE1 siRNA經(jīng)鼻內(nèi)給藥方式遞送至CNS, 用于AD的治療[57]。RVG肽功能化的SLNS和NLC可裝載槲皮素靶向BBB并誘導(dǎo)神經(jīng)元保護, 減弱AD中的Aβ聚集[58]。共修飾RVG肽和靶向線粒體的三苯基膦陽離子的紅細胞膜或巨噬細胞膜包裹的NLC成功將負載的抗氧化劑白藜蘆醇、金雀異黃素靶向遞送至神經(jīng)元線粒體內(nèi), 降低線粒體氧化應(yīng)激反應(yīng), 減輕AD癥狀, 表明了靶向修飾的納米系統(tǒng)在AD中的應(yīng)用前景[59-60]。

5.5 結(jié)合無機型NPs

JOO等[61]研究表明, 偶聯(lián)RVG肽的多孔硅–氧化石墨烯核殼納米載體能夠保護高效負載的siRNA免受核酶降解, 將其靶向遞送到損傷腦組織中, 并延遲siRNA釋放, 介導(dǎo)基因沉默。JIN等[62]構(gòu)建了RVG肽和IRDye800標記的牛血清白蛋白包被的三角形氧化釓納米顆粒, 作為神經(jīng)母細胞瘤術(shù)前診斷的靶向MRI試劑和指導(dǎo)術(shù)中精確切除腫瘤的熒光顯像劑, 使得腫瘤小鼠術(shù)后42天的存活率從0%提高到80%。這表明RVG肽介導(dǎo)的CNS靶向納米顆粒在疾病診斷和治療方面具有巨大潛力。

6 RVG肽與CNS遞送策略

目前, 穿過BBB進行CNS遞送的非侵入性策略主要涉及RMT、Ex及NPs等。RMT通過特定配體與BBB受體的結(jié)合觸發(fā)物質(zhì)攝入囊泡, 經(jīng)多階段完成轉(zhuǎn)胞吞, 是廣為研究的BBB遞送過程。理想的受體應(yīng)在BBB中高表達, 在外周低表達, 基于RMT的CNS遞送安全有效性還需臨床試驗驗證。Ex作為CNS遞送載體廣受關(guān)注, 然而, 關(guān)于Ex的來源、功能、副作用等還未完全掌握, Ex穿過BBB的具體機制尚不清楚, 且未經(jīng)靶向修飾的Ex只有少部分能夠進入腦內(nèi)。基于NPs的CNS遞送策略顯示出極大的臨床價值, 但其穿過BBB能力有限, 對NPs表面進行多功能化修飾可以增強其CNS應(yīng)用。此外, 嗜神經(jīng)病毒載體可經(jīng)鞘內(nèi)注射等侵入性方法向CNS遞送基因物質(zhì), 然其存在自身免疫的風(fēng)險[3,65]。RVG肽屬于nAChR特異性配體, 能夠以RMT進行CNS靶向遞送, 然其更多地被作為靶向配體修飾Ex、NPs, 彌補其CNS靶向性缺乏、腦內(nèi)累積量低的不足。

7 結(jié)語與展望

BBB與CNS疾病密切相關(guān), 仍然是CNS藥物干預(yù)的主要障礙。RVG肽作為CNS中nAChR特異性配體可直接介導(dǎo)核酸、蛋白質(zhì)分子通過RMT途徑穿過BBB進入CNS, 也可結(jié)合Ex、NPs介導(dǎo)高效的CNS靶向遞送。相較于RVG肽, 其他傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體、低密度脂蛋白受體等RMT靶點在多種組織中表達, 并不適用于CNS特異性遞送[11]?；赗VG肽的CNS靶向遞送策略廣泛應(yīng)用于PD、AD、卒中、腦腫瘤等疾病中, 使得核酸、蛋白質(zhì)、小分子藥物等可以跨過BBB的阻礙發(fā)揮療效, 成為一種有吸引力的CNS靶向遞送新方法。

關(guān)于 RVG肽還有一些觀點需要探究。LIU等 [66]研究表明 , RVG肽修飾的聚酰胺樹狀大分子(PAMAM)可能通過 γ-氨基丁酸受體介導(dǎo) DNA的CNS靶向遞送。FU等[67]提出來自RVG的由39個氨基酸組成的肽(RDP)可與γ-氨基丁酸受體結(jié)合, 介導(dǎo)蛋白質(zhì)的神經(jīng)元遞送。而XIN等[68]從RVG肽中重新篩選了由15個氨基酸組成的肽, 這種新篩選的RVG肽能夠介導(dǎo)脂質(zhì)體通過nAChR向神經(jīng)膠質(zhì)瘤遞送紫杉醇。這表明了RVG肽及其CNS靶向的復(fù)雜性, 還需進一步探索RVG序列及其他潛在靶點?？傊? 基于RVG肽的 CNS靶向遞送策略具有廣闊的應(yīng)用前景。

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