1．多肽合成歷史回顧

多肽化學(xué)已經(jīng)走過(guò)了一百多年的光輝歷程，1902年，Emil Fischer首先化學(xué)方法合成了自由的二肽。由于當(dāng)時(shí)在多肽合成方面的知識(shí)太少，進(jìn)展也相當(dāng)緩慢當(dāng)時(shí)合成采用了苯甲酰，乙酰保護(hù)，脫去相當(dāng)困難，而且容易導(dǎo)致肽鏈斷裂。1932年，Max Bergmann等人開(kāi)始使用芐氧羰基（Z）來(lái)保護(hù)α-氨基，該保護(hù)基可以在催化氫化或氫溴酸的條件下定量脫除，多肽合成才開(kāi)始有了一定的發(fā)展。到了20世紀(jì)50年代，隨著越來(lái)越多的生物活性多肽的發(fā)現(xiàn)，大大推動(dòng)了有機(jī)化學(xué)家們對(duì)多肽合成方法以及保護(hù)基的研究，因此這一階段的研究成果也非常豐富，人們合成了大量的生物活性多肽，包括催產(chǎn)素（Oxytocin），胰島素等，同時(shí)在多肽合成方法以及氨基酸保護(hù)基上面也取得了不少成績(jī)，這為后來(lái)的固相合成方法的出現(xiàn)也提供了實(shí)驗(yàn)和理論基礎(chǔ)。也就是這個(gè)階段，F(xiàn)red Sanger發(fā)明了氨基酸序列測(cè)定方法，并為此獲得了1958年的Nobel化學(xué)獎(jiǎng)。他后來(lái)還發(fā)明了DNA序列檢測(cè)方法，并于1980年再次獲得了Nobel化學(xué)獎(jiǎng)，成為到目前為止唯一獲得兩次Nobel化學(xué)獎(jiǎng)的科學(xué)家。1963年，Merrifield提出了固相多肽合成方法（SPPS），這個(gè)在多肽化學(xué)上具有里程碑意義的合成方法，一出來(lái)，就由于其合成方便，迅速，現(xiàn)在已經(jīng)成為多肽合成的首選方法，隨后的發(fā)展也證明了該方法不僅僅是一種合成方法，而且也帶來(lái)了有機(jī)合成上的一次革命，并成為了一支獨(dú)立的學(xué)科，固相有機(jī)合成（SPOS）。當(dāng)然，Merrifield也因此榮獲了1984年的Nobel化學(xué)獎(jiǎng)。也正是Merrifield，他經(jīng)過(guò)了反復(fù)的篩選，最終屏棄了芐氧羰基（Z）在固相上的使用，首先將叔丁氧羰基（Boc）用于保護(hù)α-氨基并在固相多肽合成上使用，其可以在酸性條件下定量的脫除，反應(yīng)也非常迅速，在30min就可以反應(yīng)完全。由于叔丁氧羰基（Boc）方法中，氨基酸側(cè)鏈的保護(hù)基團(tuán)大多基于芐基（Bzl），因此也稱為BOC-Bzl策略。同時(shí)，Merrifield在20世紀(jì)60年代末發(fā)明了第一臺(tái)全自動(dòng)多肽合成儀，并首次合成生物蛋白酶，核糖核酸酶（124個(gè)氨基酸）。隨后的多肽化學(xué)研究主要集中在固相合成樹(shù)脂，多肽縮合試劑，氨基酸保護(hù)基的研究。1972，Lou Carpino 首先將9-芴甲氧羰基（Fmoc）用于保護(hù)α-氨基，其在堿性條件下可以迅速脫除，10min就可以反應(yīng)完全，而且由于其反應(yīng)條件溫和，迅速得到廣泛使用，到了20世紀(jì)80年代取代了叔丁氧羰基（Boc），成為了固相多肽合成中的首選合成方法。該方法中氨基酸的側(cè)鏈大多基于叔丁基（tBu），因此，也稱為Fmoc-tBu策略。同時(shí)，在多肽合成樹(shù)脂，縮合試劑以及氨基酸保護(hù)，包括合成環(huán)肽的氨基酸正交保護(hù)上也取得了豐碩的成果。 進(jìn)入21世紀(jì)，隨著蛋白質(zhì)組學(xué)的研究深入，對(duì)于多肽化學(xué)的要求不僅僅是改進(jìn)合成方法，而更多的集中肽庫(kù)的設(shè)計(jì)、多肽藥物的大規(guī)模制備、多肽標(biāo)記與修飾、以及蛋白結(jié)構(gòu)與功能模擬多肽的合成以及長(zhǎng)肽或蛋白合成。 

2．多肽合成的基礎(chǔ)知識(shí) 

多肽化學(xué)合成方法，包括液相和固相兩種方法。液相合成方法現(xiàn)在主要采用Boc和Z兩種保護(hù)方法，現(xiàn)在主要應(yīng)用在短肽合成，如阿斯巴甜，力肽，催產(chǎn)素等，其相對(duì)與固相合成，具有保護(hù)基選擇多，成本低廉，合成規(guī)模容易放大的許多優(yōu)點(diǎn)。與固相合成比較，液相合成主要缺點(diǎn)是，合成范圍小，一般都集中在10個(gè)氨基酸以內(nèi)的多肽合成，還有合成中需要對(duì)中間體進(jìn)行提純，時(shí)間長(zhǎng)，工作量大。固相合成方法現(xiàn)在主要采用Fmoc和Boc兩種方法，它具有合成方便，迅速，容易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，而且可以比較容易的合成到30個(gè)氨基酸左右多肽。 
2.1．氨基酸保護(hù)基
    20種常見(jiàn)氨基酸，根據(jù)側(cè)鏈可以分為幾類：脂肪族氨基酸（Ala，Gly，Val，Leu，Ile，），芳香族氨基酸（Phe，Tyr，Trp，His），酰胺或羧基側(cè)鏈氨基酸（Asp，Glu，Asn，Gln），堿性側(cè)鏈氨基酸（His，Arg， Lys），含硫氨基酸（Cys，Met），含醇氨基酸（Ser，Thr），亞氨型基酸（Pro）。多肽化學(xué)合成中氨基酸的保護(hù)非常關(guān)鍵，直接決定了合成能夠成功的關(guān)鍵。因?yàn)槌Ｒ?jiàn)的20中氨基酸中有很多都是帶有活性側(cè)鏈的，需要進(jìn)行保護(hù)，一般要求，這些保護(hù)基在合成過(guò)程中穩(wěn)定，無(wú)副反應(yīng)，合成結(jié)束后可以完全定量的脫除。合成中需要進(jìn)行保護(hù)的氨基酸包括：Cys，Asp，Glu，His，Lys，Asn，Gln，Arg，Ser，Thr，Trp，Tyr。需要進(jìn)行保護(hù)的基團(tuán)：羥基，羧基，巰基，氨基，酰胺基，胍基，吲哚，咪唑等。在特殊的情況下，有些氨基酸也可以不保護(hù)，象Trp，Asn，Gln，Thr，Tyr。 

圖1 常見(jiàn)3種氨基保護(hù)基結(jié)構(gòu)

氨基酸側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)非常多，同一個(gè)側(cè)鏈有多種不同的保護(hù)基，可以在不同的條件下選擇性的脫除，這點(diǎn)在環(huán)肽以及多肽修飾上具有很重要的意義。而且側(cè)鏈保護(hù)基和選擇的合成方法有密切的關(guān)系，液相和固相不一樣，固相中Boc和Fmoc策略也不一樣，從某種意義上看，多肽化學(xué)就是氨基酸保護(hù)基的靈活運(yùn)用與搭配。關(guān)于側(cè)鏈保護(hù)基的使用，請(qǐng)參考黃惟德《多肽合成》的有關(guān)章節(jié)，這里簡(jiǎn)單介紹Cys，Lys，Asp的幾種保護(hù)基及其脫除方法。Cys最常見(jiàn)的保護(hù)基有三種，Trt，Acm，Mob，這三個(gè)保護(hù)基可以完成多對(duì)二硫鍵多肽的合成。Lys最常見(jiàn)的保護(hù)基有：Boc，F(xiàn)moc，Trt，Dde，Alloc，這對(duì)于固相合成環(huán)肽提供了很多正交的保護(hù)策略。Asp最常見(jiàn)的保護(hù)基有：OtBu，OBzl，OMe，OAll，OFm，同樣也提供了多種正交的保護(hù)策略。

表1 巰基常見(jiàn)保護(hù)基

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